1、GB/T 14924. 11- 2001 本标准的全部技术内容为推荐性的。前雪主仨本标准从GB14924-1994(实验动物全价营养饲料中分离出来，形成独立的标准。本标准中所列两种方法具有同等效力。本标准及其配套标准自实施之日起.代替GB14924-1994。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位2中国实验动物学会。本标准主要起草人:周瑞华、王竹、石磊、主光亚、张疏、郑陶、刘秀梅。本标准由国家科学技术部委托技术归口单位中国实验动物学会负责解释。本标准于1994年1月首次发布。,1 I 1 范围中华人民共和国国家标准实验动物配合饲料维生素的测定Laboratory anima
2、ls-:Formula feeds Determination of vitamins GB/T 14924.11-2001 代替GB14924 1991 本标准规定了实验动物配合饲料中维生素的测定方法，即配合饲料中维生素A、维生素E、维生素也、维生素B2、烟酸、维生素B，、总抗坏血酸、总胆碱、叶酸、维生素B、维生素K3泛酸、生物素、维生素队的测定方法。本标准适用于实验动物小鼠、大鼠、兔、豚鼠、地鼠、犬和猴的配合饲料及其原料的测定。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准时的各方应探讨使用下列标准的
3、最新版本的可能性。GB/T 12388-1990 食物中维生素A和维生素E的测定方法GB/T 12390-1990 食物中硫胶萦(维生素B，)的测定方法GB/T 12391-1990 食物中核黄素的测定方法GB/T 12392-1990蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定方法荧光法和2.4二硝基苯胶法GB/T 12395-1990 食物中烟酸的测定方法GB/T 14700一1993饲料中维生素B，测定方法GB/T 14701-1993 饲料中维生素B2测定方法G/T 17407-1998 食物中维生素队的测定GB/1 17812-1999 饲料中维生素E的测定高效液相色谱法Gll/T 1781
4、6-1999 饲料中总抗坏血酸的测定邻苯二胶荧光法GB/T 17817-1999饲料中维生素A的测定高效液相色谱法GB/T 17818-1999饲料中维生素队的测定高效液相色谱法3 测定方法3. 1 配合饲料中维生素A和维生素E的测定按G/112388、GB/T17812、GB/T17817的规定执行。3. 2 配合饲料中维生素矶的测定按GB/T14700、GB/T12390的规定执行。3. 3 配合饲料中维生素民的测定按(;B/T12391、GB/T14701的规定执行。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2001-08-29批准2002- 05-01实施3. 4 配合饲料中烟酸的测定按G
5、13/T12:95规定执行c3. 5 配合饲料中维牛素日民的测定按G13/T17飞2式中X一一样品中胆碱的含量，mg/l00g，一一从标准回归曲线上查得的胆碱含量，mg;V , 样品提取液定容体积.mL;V2 纯化用提取液的体积，mL;M一样品质量，g。3. 7. 6 结果的允许差同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值运10%。3.8配合饲料中nt酸的测定微生物法3. 8. 1 原理( 1 ) 叶酸是干酷乳酸杆菌(Lactobailluscasei ,L, C , A TCC7 469)生长所必需的营养素。在A定条件下LC的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖强度用测定吸光
6、度值表示。与标准曲线相比较.计算出样品中叶酸的含量。本方法检出限为O.1 ng 0 3.8.2 试剂本实验用水均为蒸馆水。试剂纯度除特别注明外均为分析纯。3.8.2.1 甲苯。3.8.2.2 生理盐水:使用前需灭菌处理。3. 8.2.3 菌种:干酷乳酸杆菌(Lactobacilluscasei ,L. C ,A TCC7 469) 3. 8. 2. 4 磷酸缓冲液(0.05mol/L.pH6. 8)，称取4.35g磷酸销(Na，PO，12H,O) , 10. 39 g磷酸氢二纳(Na2HPO， 7H，O)溶解于800mL水中，临用前加入约5g抗坏血酸，并调节pH至6.8 , 3.8.2.5 鸡
7、膜酶2称取100mg干燥的鸡膜酶，加入20mL磷酸缓冲液制成匀浆，3000 r/min离心10 min，取上清液备用，临用前配制。3. 8.2.6 蛋白酶淀粉酶:分别称取蛋白酶和淀粉酶各200mg，加入20mL磷酸缓冲液制成匀浆，3 000 r /min离心10mm门取上清液备用。i陆用前配制。3. 8. 2.7 氢氧化纳溶液(0.01mol/L)，用20%乙醇配制。3.8.2.8 氢氧化纳溶液(Omol/L)。3. 8.2.9 叶酸标准储备液(200周/mLl，准确称取200mg时酸标准品.用0.01mol/L氧氧化制熔液溶解并定容至11-0储存于棕色瓶中。GB/T 14924. 11 -
8、2001 3.8.2.10 叶酸标准中间液(200ng/mL)，吸取.0 mL叶酸标准储备液.用0.01ml/L 乱氧化饷溶液溶解)j定容至1L 0储存于棕色瓶中。3.8.2.11 叶酸标准应用液(0.2ng/mLl吸取.0 mL叶酸标准中间液，用磷酸缓冲液稀释定容至l L, 3.8.2.12 酶解酷蛋白:将8g碳酸氢纳溶解于1L水中，加入60g去维生素酶蛋臼，用10mol/L氢氧化纳溶液调节pH至8.0。加入300mg膜酶.搅拌20min，使膜酶充分混匀。再加入2.5mL甲苯，置37Ct，j温箱酶解4872h 。将酶蛋白从恒温箱中取出，经121C高压30min以终止反应，去除甲苯。冷却，加1
9、0g硅藻土(技术级)搅拌，用布氏漏斗过滤。滤液中加入约60mL冰乙酸调节pH至3.70称取活性炭12g.加至滤液中搅拌10min，用布氏漏斗过滤，重复二次。每次过滤时，布氏漏斗内加10g硅藻土助滤。最后滤液用水稀释至1200mL，冰箱保存。取一小份酶解赂蛋白液进行千燥处理，如固体含量小于40mg/mL，则需重新制备。3.8.2.13 黄瞟岭溶液:取0.4g黄喋岭，加入10mL氨水，加热熔解.用水稀释至100mL，冰箱保存。3- 8.2.14 腺瞟岭鸟嚓岭尿略院溶液.分别称取硫酸腺瞟岭.盐酸鸟嗦岭和尿略院各O.2 g，加入0+4)就酸榕液，加热溶解，用水稀释至100mL室温贮存。3.8.2.15
10、 乙酸缓冲液(1.7mol/L.pH4. 5) , 38. 65 g乙酸销，19.8mL乙酸，加水至500mL。3.8.2.16 维生素溶液:取10mg核黄素溶解于40mL乙酸缓冲液中。取0.2mg生物素，2.5 mg碳酸氢俐，20mg对氨基苯甲酸，40mg盐酸毗多醇，4mg盐酸硫胶素，8mg泛酸钙.8mg尼克酸溶解于50 mL水中。将上述两种溶液混合，加水至100mL。3.8.2.17 吐温-80溶液2将2g吐温80加入100mL45 C水中，混匀。3.8.2.18 还原哼J谷脱甘肤榕液:取0.1g还原型谷脱甘肤，!Ju7.k溶解至100mL。3.8.2.19 甲盐溶液:称取5g磷酸氢二何和
11、2g磷酸二氢饵，加水溶解至100mL.液面t加入少许甲苯以保存之。3.8.2.20 乙盐溶液:称取2g硫酸馁，0.5 g硫酸亚铁和0.5g硫酸钮，加水溶解至100mL，液面上加少许甲苯以保存之。3.8.2.21 基础培养基酶解酷蛋白100mL，腺螺岭鸟嚓岭尿略院溶液2.5mL，黄瞟岭溶液2.5 mL , 维生素溶液5mL，吐温-80溶液2.5mL.L天冬氨酸。.3g ，L盐酸半眈氨酸。.2 g，还原型谷脱甘肤溶液2.5mL，葡萄糖20g，乙酸纳2饨，甲盐溶液2.5mL，加水至250mL.搅拌，用氢氧化纳溶液调节pH歪6.8土。1，然后加入乙盐溶液2.5mL，磷酸缓冲液200mL，用水补至500
12、mL，冰箱内可保存一周。3.8.2.22琼脂培养基葡萄糖1g，蛋白脐、O.8 g，酵母提取物F粉O.2 g.乙酸锅(NaAc 3日/)1. 7 g，甲盐熔液。.2mL，乙盐溶液。.2mL.琼脂1.2g加水至100mL，置水浴煮至琼脂完全熔化，调节pH至6.8士0.10尽快倒入试管中，每管35mL.塞上棉塞，121C高压灭菌15min，取出后直立试管，冷均p至室温，于冰箱内保存。3.8.3 仪器与设备3.8. 3- 1 实验室常用设备。3. 8. 3- 2 恒温培养箱。3.8.3.3 离心机。3- 8. 3. 4 高压消毒锅。3. 8. 3- 5 震荡器。3.8.3.6 接种针和接种环。3- 8
13、. 3- 7 分光光度汁。3. 8. 4 菌种制备与保存3- 8.4.1 储备商种的制备将L.C纯菌种转接至2个或多个琼脂培养基管中。(37士。.5)C恒温培养箱中l自养1624h，贮于冰箱内，每周转种一次留作储备菌种。-, 1 S GB/T 14924.11 . 2001 3. 8. 4. 2 种子悄养液的制备:取2mL时酸标准应HI液和1 rnL基础培养基.混匀.分装至4支5mL 离心管中，寒t悔塞.121C高压灭雨15nlln，备JtL3. 8. 5 测定步骤(所有操作均需避光进行)3. 8. 5. 1 接种液的制备使用前一天，将囱种lli储备菌种管中转种至2支己灭茵的种子珞养液中.Cl
14、7士)(恒温培养箱中培养1621h。次日晨.t昆悬种子培养液，无菌操作下吸取0.2mL.将细菌转种至另2支灭菌的种子培养液巾.(37土O.5) (再培养6h。取出3000 r /min，离心10mm.倾去上清液，用已欠陆的1理盐水泊洗二A次.离心.弃去t清液。最后Ju mL生理盐水，震荡?昆匀.制成前种混屈、液。ti句Ji* J目。3- 8. 5. 2 样品制备3- 8.5.2.1 样品处理将样品磨成粉末。3- 8. 5. 2. 2 水解:称取O.1 O. 5 g样品(约含叶酸100300ng)于100mL锥形瓶巾.加入50mL磷酸缓冲液，l昆匀。121C高压水解15mmo3.8.5.2.3
15、酶解:水解样品冷却后，加入1mL鸡膜酶.1mL蛋白酶淀粉酶，LmL甲苯，充分混合(371l.C,) (恒温培养箱中酶解1620h。取出酶解样品用水定容至100mL.过滤。取2mL滤液稀释至20 mL，使叶酸终含量在O.1 O. 3 ng/mL范围之内。同时另取一支试管，加入1mL鸡滕酶，1mL蛋白酶淀粉酶，作酶空白对照。3.8. 5. 3 标准系列管的制备耳)(2组平行试管，每管分别加入叶酸标准应用液。.0，0.5，).0 , 2. 0 , 3. 0.4. 0.5. 0 mL.相当于叶酸含各t0 , 0. 1. O. :， Q. ;j , 0. 6, O. 8 ,1. 0吨，加水补至5.0mL
16、.再加5mL基础培养基.昆匀。3-8.5.4 样品管的制备取4组试管，每管分别加入酶解样品1.0.2.0.3.0.4.0mL.补充水至体积为5.0mL，再加5mL基础培养基.混匀。3- 8. 5. 5 灭菌:将以上标准系列管、样品管和酶空白管全部塞上棉塞.121C高压灭菌15min 0 3. 8. 5. 6 接种2待标准系列管、样品管和酶空白管冷却至室温，在元菌操作条件下接种，每管接种一滴接种液，直接滴在结养基内。留一支标准。管不接种，用于测定吸光度时调零。3. 8. 5. 7 培养置于(37土0.5)C恒温培养箱中培养2040ho 3- 8. 5. 8 测定:用分光光度计，波长540nm下，
17、以未接种的标准。管调吸光度值为0，测定标准管、样Ilh fi和酶空白管的吸光度值。3. 8. 5. 9 绘制标准曲线以uU较标准系列含量作横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。3.8.6 结果计算见;(2)。X生二PlX V X 10 X 100 .HH-. . .( 2 ) m X 1 000 式1, X 样品中叶酸含量，g/100g，c 从标准曲线上查得每毫升样品测定管中叶酸含量.ng/mLj P 酶空白对照管中叶酸含量，吨/mL，V 样品酶解被定容总体积，mL;m 样品质量.g ; l 稀释倍数，I (的/1O()-样品含量由ng/g换算成g/100g的系数。3- 8. 7 允叶误差I
18、,;J 实验室平行测定或重复)结果相对偏差绝对值二lO币。丁jD 3. 9 配合饲料中维生素巳2的测定3. 9. 1 JJU理GB/T 14924.11 2001 ?作叶飞素B，、I于!，a(fobacillusleich川annii(ATCC7830)的正常牛长是必需的营养素.在一定呼长条件下.1.山tobacill川leichmnnii的牛长繁殖与溶液中维生素B1的含量成定的线I关系-MR且光度测定法测定细菌生长繁殖的强度.即可计算出食物及饲料样品中的维生素B，巳含量。丰ilLJ是低价出限为0.001 ng 3. 9. 2 试剂斗三试俭所用水均为羔榴*.所用试剂均需分析纯试剂、3.9.2.
19、1 甲苯3- 9. 2. 2 拧橡酸CC，H，O， 3H)。3.9.2.3 磷酸氢工纳CNa，HPO，), 3.9.2.4 偏重亚硫酸例CNa品O.)。3. 9. 2. 5 抗坏血酸(生化试剂)。3- 9. 2. 6 元水葡萄糖。3.9.2.7 元水乙酸锅。3. 9. 2. 8 L恍氨酸(生化试剂)。3. 9.2.9 !)，L色氨酸(生化试剂)。3.9.2.10 10 mol/L氢氧化销溶液z称取200g氢氧化饷榕于适量水中.定容至500时，3- 9.2.11 (1十4)乙醇溶液，200mL无水乙醇与800mL水充分混匀。3- 9.2.12 酸解酷蛋白:称取50日不含维生素的酸蛋白于500mL
20、烧杯中.加1200 mL3 mol/L盐酸，纶121 (高压水解6h。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴t蒸发至膏状。加200mL水使之溶解后f蒸发至西状，如此反复3次，以去除盐酸。以澳酣蓝作外指示剂.用10mol/L氢氧化纳济液调节pH学3. )加20g活性炭，振摇，过滤，如果滤液不呈淡黄色或元色，可用活性炭重复处理。滤液hu水稀释至500 mL，液面上加少许甲苯于冰箱中保存。(该试剂也可从Dfico公司购得，产品号为刊Q.0288-15-6,) 3- 9.2.13 腺瞟岭、鸟嗦岭、尿略脆溶液:称取硫酸腺瞟岭(纯度为98%)、盐酸鸟瞟岭(生化i式剂)以及尿略院各(1.1 g于250mL烧杯中.
21、加75mL水和2mL浓盐酸，然后加热使其完全熔解冷却。若有17L淀卢F仁.hu盐酸数漓，再加热，反复至冷却后元沉淀产生为止，用水稀释至100mL。液面上IJU少许叶i苯f冰箱中保布一。3.9.2.14 维生素溶液I称取25mg核黄素.25mg盐酸硫胶素，0.25mg生物素，50mg尼克酸，用。.02 mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000 mL , 3- 9.2.15 维生素溶液I，将50mg对氨基苯甲酸.25mg泛酸钙.100mg盐酸毗哆醇，100mg盐酸毗哆1W.20mg盐酸毗哆胶，5mg叶酸溶于(1十4)乙醇溶液并定容至1000 mL, 3.9.2.16 甲盐溶液称取25g磷酸二氢仰、2
22、5g磷酸氢二饵溶于500mL水中，JJu5滴浓盐酸01昆匀3.9.2.17 乙盐溶液，称取10g硫酸援CMgSO， 7H，O)、O.5 g氯化锅、0.5g硫酸锚CMnS川-1H ，(忡.O. S g硫酸亚铁(FeSO， 7H，Ol溶于水并定容至500mL.加5滴浓盐酸，混匀。3- 9.2.18 黄瞟岭溶液称取1.0 g黄瞟岭溶于200mL水中，70C加热条件下，加入30mL氮氧化饺(:-JH，OH)C2十川，搅拌直至固体全部溶解，冷却后用水定容至1000 mL , 3.9.2.19 夭冬Ilit胶榕液:称取1.0gL天冬M胶溶于水中，并定容至100mL 3.9.2.20 吐温80溶液:将25g
23、吐温80溶于乙醇并定容至250mLo 3- 9.2.21 维生素Bn:标准溶液(均使用棕色试剂瓶儿3. 9. 2. n 1 维哇素B标准储备溶液CIOOng/mLl称取50g(精度0.01mg犬平)维1素B暗红色钊状纺品，月J(+4)的乙醇济液定容至500mL.4 C冰箱储存。3- 9. 2. 21. 2 维生素Bl标准中间液(lng/mL)，取2.5mL储备液用(l十4)的乙醇定容至250ml. 4 ( GB/T 14924. 11 - 2001 冰箱储存。3. 9. 2. 21. 3 维生素标准应用液(0.02 ng/mL)取1mL中间液用水定容至50ml.,)f! a寸现配。3.9.2.
24、22 基本培养基:在本标准的制作中使用JDifco公司产品，产品号为No.0457- J 10也叮如ll自己配制:寄F列试剂混合于500mL烧杯中，加水至200mL.以澳甲盼紫作外指示剂，用10mol汀，氢氧化饷液调节pH为6.06.1.用水稀释至250mL。酸解酷蛋白25 mL 腺嚓岭、马嚓岭、尿嗜咬溶液5 mL 天冬氨酸溶液5 mL 口j温80洛液rp盐熔液乙盐溶液维当素溶液I维生素溶液E黄嗦岭溶液抗坏血酸L-脱氨酸5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 1. 0 g O. 1 g I).L色氨酸。1g 龙水筒萄糖10.0日元水乙酸销8.3 g 3.9.2.23琼脂宿养
25、基.在600mL水中，加入日在蛋白陈，5g水溶性酵母提取物干粉，10g元水能萄糖.2且无水磷酸二氢梆，100mL番茄汁.10mL吐温80溶液，每500mL液体培养基加).Q-._, 7.;) g琼脂.力11热溶解.用10mol/L氮氧化销调节pH为6.56.8，然后定容至1000 mL，分装于试管中于1Zl(岗压灭的10mm取出后竖直试管，待冷却至室温后于冰箱保存，3.9.2.24 生理盐水:称取9.0g氯化纳溶于1000 mL水中。每次使用时分别倒人21支试管中每支约加I10 ml.，塞好棉塞，于121C高压灭菌10min.备用。3. 9.2.25 0.1 g/L澳甲盼紫指示剂:称取O.1
26、g澳甲盼紫于小研钵内.加1.6mLO. 1 mol/L氢氧化纳由f肘，加少许水继续研磨.直至完全溶解，用水稀释至250mL。3.9.3 仪器与设备3. 9. 3. 1 实验室常用设备。3.9. 3. 2 电热恒温培养箱。3. 9. 3. 3 压力蒸汽消毒器。3. 9. 3. 4 液体快速混合器。3. 9. 3. 5 离心机。3.9. 3. 6 硬质玻璃试管20mmX 150 mm。3. 9. 3. 7 分光光度计。3. 9.4 I组种与编养液的串l备与保存3. 9.4.1 储备菌种的制备，Lactobacillusleichmannii (A TCC 7830)接种子直面琼脂培养管中，在(37
27、+ O. C, ) C恒温箱中培养1624h，取出后放入冰箱中保存，每隔两周至少传种一次。在实验前-天必须传和l次。3. 9.4.2 种fJ:吉养液的制备:加2mLO. 02 ng/mL维生素BI2标准工作液和:1mL基本培养基于10mL 离心管中，塞好棉塞，于121C高压灭菌10mm，取出冷却后于冰箱中保存。每次制备两管，备用3. 9. 5 操作步骤GB/T 14924.11 - 2001 3.9.5.1 接种液的配制使用前-天，将已在琼脂管中生长16、24min的L.leichmannii:圭种于种子培养液中.在(37士。.5)C培养1624h，取出以3000 r/min离心10min，弃
28、去上清液，用已灭菌的生理盐水淋洗2次，再加入3mL灭菌生理盐水，混匀后，将此液倒入己灭菌的注射器中，供接种用。3. 9. 5. 2 样品制备3- 9.5.2.1 水解液的制备z称取1.3 g元水磷酸二氢纳、1.2 g拧攘酸及0.1g偏重亚硫酸纳CNa ,S ,()c,) .溶于水中并定容至100mL.用时现配。3- 9. 5. 2. 2 称取适量样品，置于100mL三角瓶中.加70ml水解液，混匀，于121C高压灭菌10min。取出玲却至室温，过滤。以澳甲盼紫为外指示剂，用10mol/L氢氧化纳溶液调节pH至6.06.1.将水解被移至100mL容量瓶中，用水定容至如j度。样品需进行适当稀释，使
29、测定管中Na，S，O，终浓度应飞二0.0:1mg/mL。3- 9. 5. 3 样品试管的制备每组平行样品管中分别加入).0 , 2. 0.3. 0,4. 0 mL样品水解液，并用水稀释至5mL，然后再加入S mL基本液体培养基。3.9.5.4 标准系列管的制l备f且试管中分别加入维生素312标准工作液。.0.1.0.2.0.3.0，4.0.5.0mL.使每组试管中维生紊乱二的含最为0.00ng.O. 02 ng.O. 04鸣.0.06吨.0.08吨，0.鸣，加水至5mL.再加入5mL基本液体培养某.需做王组标准曲线。3.9.5.5 灭菌:样品管与标准管均用棉塞塞好，于121C高压灭菌10mmo
30、 接种勺培养，待试管冷至室温后，每管接种滴种子菌液.于(37士。.5)C恒温箱中培养1620ho 3- 9. 5. 6 由吸光度:于640nm波长条件下，以标准系列中的零管调节仪器零点.测定样品管液体及标准管培养物的吸光度值。3.9.6 汁算以维生素吕12标准系列的ng数为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。由样品测定管中的吸光!主ff在曲线t查出相对应的样品测定管中的维生素B】2含量，再按以式(3)计算样品中维生素1312含量c v . f x=二一一一_X 100 m X 10 式小:X样品中维生素B17含量，g/IOOg;00mL含O.J g碳酸钩的冷却水巾.并用冷却的水稀释至1IJ
31、IJ I) ml.。3.10.2.3 淀粉指示剂称取2日可榕性淀粉加于10mL水中.摇匀。然后缓慢加至200ml沸水中.煮2min。3.10.2.4 氨水异内醉溶液.取异l苟醇与等体积的浓氮水混合。3.10.2.5 氨乙酸乙醋C30g/L)，取3g氧乙酸乙酣溶解7100 mL异丙醇中。3.10.2.6 Vk标准溶液(0.1mg/mL)准确称取50mgVk标准品，移至500mL棕色容量瓶中.用异丙醇熔解并定容至刻度。3.10.3 仪器与设备3. 10. 3. 1 实验室常用设备。3.10. 3.2 分光光度计。3. 10. 4 测定步骤(所有操作均需避光进行)3.10.4.1 提取准确称取约15
32、g己混匀的样品，准确加入100mL水，搅拌10min，保证Vk，充分溶解与混匀。过Jt.如滤液浑浊，则反复过滤至澄清。3. 1叩0.4.2氧化去杂质.吸取4omL滤液至10OmL容量瓶中加12滴淀粉指示剂用0.1m丑101/几/浴J液住滴定至出1现持续的蓝包q向溶液中滴入1滴0.1mol/LNa，S，o，消除蓝色。用水定容至刻度。3.10.4.3 标准管和样品管的制备z分别取2套20mL比色管.分别按表1顺序加入Vk标准熔液、样品提取液及试剂，制备标准管和样品管。表1标准管和样品管的制备标准管样品管测定管寸试剂。1 2 3 4 空白管Vk.，标准溶液.mL0.0 o. 5 1. 0 1. 5
33、2. 0 样品提取液，mL10. 0 10. 0 异丙醇.mL3. 0 1.50 1. 0 Q. 5 O. 0 3. 0 2.0 乙基佩乙酸嘈mL1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1.0 氨水一异丙醇.mL1. 0 1.0 1.0 1. 0 1. 0 1.0 1.0 各管用水定容至20mL.摇匀，放置20mlfi。3. 10. 4-4 比色测定用分光光度计于575cm波长下，以标准。管调仪器零点，测定各管吸光度值。3.10.5 计算:以标准Vk，含量作横坐标，吸光度值作纵坐标，并绘制标准曲线，计算回归方程。用样品测定管与空白管吸光度值的差值在标准曲线上查出样品管的Vk，含量.然后计算出样
34、品中Vk.1的含量，见式(4 )。二，X 25 x=二二二L一一X 100 m 式中，x样品中Vk，的含量.mg/l00g; c内一样品测定管与空白管吸光度值的差值在标准曲线仁对应的Vk，含量，mg;m 样品质量.g ; 25一样品稀释倍数。3. 10. 6 结果的允许差同实验京平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值M 1旺;各O.1 g于250mL烧杯中，加75mL水和2mL浓战酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产哇，加盐酸数滴，再加热，如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止，以水稀释至100mL。液面上加少许Ij1苯于冰箱中保存。3. 12.2.9 维生素溶液称取20mg核黄素，10mg
35、盐酸硫胶素，10mg对氨基苯甲酸，40mg盐酸毗哆醇，用。.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000 mL , 3.12.2.10盐溶液称取10g硫酸簇(MgSO， 7H2(川、1g氯化饵、O.5 g硫酸锺(MnSO， 4H20) , 0.5 g硫酸亚铁(FeSO， 7H20).加23mL85%磷酸，用水溶解并定容至500mL。3- 12.2.11 生物素标准溶液3. 12. 2. 11- 1 生物素标准备液(50吨/mL)，称取25mg无水生物素用(1十1)乙醇溶液定容至500 mL，于4C冰箱中贮存。3.12.2.11.2 生物素标准中间液1(1月/mU取5mL储备液用0+1)的乙醇溶液
36、定容至250mL , 于4c冰箱中贮存。3.12.2.11.3 生物素标准中间液II(1 0 ng/mU ，取5mL中间液I用(1+1)的乙醇溶液定容500mL. 于4C冰箱中贮存。3- 12.2.11.4 生物素标准应用液(0.2 ng/mU，取5mL中间液E用50%的乙醇溶液定容至250mL. 白2-4C冰箱中贮存。3. 12.2.12 基础培养基:本标准的制作采用Difco公司的培养基，产品号为No.0419-15-8，也可按如下配且自行配制。将F列试剂混合于500mL烧杯中，加水至200mL.以澳廓香草盼蓝作外指示剂，用10mol/L氧氧化制液调节pH至6.8.用水稀释至250mL ,
37、 酸解酷蛋白25 mL 脱氨酸、色氨酸溶液25时，腺瞟岭、鸟瞟岭、尿略睫溶液5 mL 维生素溶液5 mL 盐1容液5 mL 尤水葡萄糖。8， , GB/T 14924.11一2001无水乙酸纳5 g J12.2.13 琼脂培养基在600mL水中，加入15g蛋白陈，Jg水溶性酵母提取物1粉.1 () g元水葡萄糖.2g无水磷酸二氢斜.100扫过，番茄汁.10rnL吐温80.5.0-7.5区琼脂.加热溶解用(2十引氮氧化锵调节pH为6.5-6.8.然后定容至1000 mL，分装于试管，于12(、高压欠的10min.取出后竖瓦试管噜待冷却至室温后于冰箱保存。J 12. 2.14 生理盐水:称取9.0
38、g氯化纳溶于1000 mL水中.每次使用时分别倒入2-4支10mL试管中，每支约加10mL。塞好棉塞.于121C高压灭菌10min.备用。3.12.2.15 0.4 g/L澳靡香草盼蓝溶液.称取Q.lg澳靡香草酣蓝于小研钵内，加1.6mLO. 1 mol/L 氢氧化纳研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mLo J12.2.160.4g/L澳甲酣绿溶液:称取O.1 g澳甲盼绿于小研钵中，加1.4mLO. 1 mol/L氢氧化纳研磨.JJn少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。J 12. 3 仪器与设备3. 12.3.1 实验室常用设备。3.1 2. 3.2 电热恒
39、温培养箱。3.12.3.3 压力蒸汽消毒器。J 12. J 4 液体快速混合器。J12.3.5 离心机。J 12. J 6 分光光度计。J 12.3. 7 硬质玻璃试管:20 mm X 150 mm 0 3.12.4 菌种与培养液的制备与保存3. 12.4.1 储备菌种的制备Lactob.山illus户lanlarum(ATCC8014)接种于直面琼脂培养管中，在(37士O. 5) (恒温箱中培养16-24h.取出后放入冰箱中保存，每隔两周至少传种一次。在实验前天必须传种次。3.12.4.2 种子培养液的制备2加2mL生物素标准应用液和3mL基本培养基于10mL离心管中，塞好棉塞.于121C高
40、压灭菌10min，取出，冷却后于冰箱中保存。每次制备两管，备用。J 12. 5 操作步骤312.5.1 接种液的配制z使用前一天，将己在琼脂管中生长16-24min的L.ptantarum接种于种子堵养液中，在(37士0.5)C培养16-24h.取出后离心10min(3 000 r/阳时，弃去上清液，用己灭菌的生理盐水淋洗2次，再加入3mL灭菌生理盐水，混匀后，将此液倒入已灭菌的注射器中，备接种用。3- 12.5.2 样品制备z称取适量样品，放入100mL三角瓶中，加50mLl mol/L硫酸(水解动物样品用3 mol/L硫酸，水解植物样品及混合型样品用1mol/L硫酸).混匀后于121C高压
41、水解90min.取出冷却至烹温。以澳甲曾告绿为外指示剂，用(2十3)氢氧化锹溶液调节pH为4.5.将水解液移至100mL容量瓶中，;4:容，过滤。样品水解液只能4C冰箱保存2-3日。取适量水解液于25mL具塞刻度试管中，以澳腊香草酸蓝为外指示剂，用。.1mol/L氢氧化纳溶液调节至pH为6.8.用水稀释至刻度。3- 12. 5. 3 样品管的制备于平行样品管中分别加入.0.2. 0.3. 0.4. 0 mL样品水解液，加水至5mL，然后再加入5mL基本液体培养基。3- 12.5.4 标准系列管的制备每组试管中分别加入生物素标准工作液0.0.1.0.2.0.3.0.4.0.5.0mL. (相当于
42、0.0.0.2.0.4.O. 6. O.日.1. 0鸣加水至51L，再加入5mL基本液体培养基.需做Jtf且标准曲线。3- 12.5.5 灭菌:样品管与标准系列管均用棉塞塞好，于121C高压灭菌10min 0 3.12.5.6 接种与培养:待试管冷至室温后，每管接种一滴种于液，于(37士。.5)C恒温箱中培养16-2() h 0 :比GB/T 14924.11- 2001 3.12.5.7 测定.分光光度计，波长550nm条件下吨以标准系列零管仪器调零测定样品管反标准货的吸光度值。3昼12.6l算以生物素标准系列的ng数为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。在曲线查出相对应的样品测定管中的生物素含量，然后再接式(6)计算样品中生物素含量。c X V x f x=一一一一一一一X100 m X 1000 式巾X一-样品中生物素含量，g/IOOg; L 测定管中的生物素含量，ng/mL;V 样品水解液的定容体积，mL;f.-样品液的稀释倍数号m 样品质量.g，3. 12. 7 结果的重复性同一实验交重复测定或同时测定两次的结果的相对偏差绝对值;10%。3.13配合饲料种维生素D.，的测定高效液相色谱法按Gll/T17818-1999中规定进行测定。 ( 6 ) 12(i
