1、ICS 07.100.30 C 53 道自中华人民共和国国家标准G/T 19915.4-2005 猪链球菌2型三重PCR检测方法Method of detecting Streptococcus suis type 2 by triple-PCR 2005-09-27发布中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局中国国家标准化管理委员会2005-11圄01实施060609000418 GB/T 19915.4-2005 前猪链球菌2型是链球菌属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等。人可通过伤口感染该菌，并导致死亡。为了区别正常猪所携带的猪链球菌2型无毒菌株与发病猪分离的致病菌株
2、，特制定本标准。本标准是采用现代分子生物学诊断技术制定的。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位z南京农业大学。本标准主要起草人:陆承平、姚火春、范红结、何孔旺。I GB/T 19915.4-2005 猪链球菌2型三重PCR检测方法1 范围本标准规定了猪链球菌2型英膜基因Ccps2)、溶菌酶释放蛋白基因Cmr)和orf2这三个毒力基因的三重PCR检测技术。本标准适用于由猪链球菌2型致病2 规范性引用文件是否可使用这些文件3 术语和定义3.1 猪链球菌2猪链球菌血清型。猪链均一种重要的人畜4 测定方法4.1 方法提要挑取可疑细菌4.2 试剂和材料u
3、是猪链球菌的一个哥病原菌。除另有规定，所用、4.2.1s2、mrp和orf24.2.2 Taq DNA聚合酶。4.2.3 琼脂糖:电泳级。4.2.4 澳化乙链。4.2.5 分子量标记:DL-2000。4.2.6 TE缓冲液:10mmol/LTris-HClCpH 8.0) , 1 mmol/L EDTACpH 8.0)。4.2.7 10XPCR缓冲液:100 mmol/L KCl , 160 mmol/LCNH4 )2S04 , 20 mmol/L MgS04 , 200 mmol/L Tris-HCICpH 8.的，1%TritonX-100 , 1 mg/ mL BSA。4.2.8 电泳缓
4、冲液:242 g Tris碱，57.1 mL冰乙酸，100mL O. 5 mol/L EDTACpH8. 0)，加蒸馆水至1 000 mL，使用时10倍稀释。4.2.9 加样缓冲液:0.25%澳酣蓝，40%煎糖。4.2.10 阳性对照猪链球菌2型HA9801株基因组DNA模板，阴性对照马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板。GB/T 19915.4一20054.2. 11 猪链球菌2型三重PCR反应混合物。4.3 仪器和设备4.3. 1 离心机。4.3.2 DNA热循环仪。4.3.3 核酸电泳仪。4.3.4 pH 计。4.3.5 移液器:10L
5、、20L、100L、1000L。4.3.6 紫外线透射仪或凝胶成像系统。4.3.7 恒温水陆锅。4.4 PCR操作步骤4.4.1 阳性对照和阴性对照DNA模板的提取分别将猪链球菌2型HA9801、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株接种于5%棋牛血清Todd-H weitt肉汤培养基，370C摇振培养18h，用革兰民阳性细菌柱离心式基因组DNA小量抽提试剂盒提取DNA模板，一20C保存备用。4.4.2 PCR扩增用铅金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型三重PCR反应混合物的PCR管中，混匀，加入Taq酶(2U/fLL) 0.7L，2000 r/mi
6、n离心10s，立即进行PCR扩增;同时设去离子水的空白对照、猪链球菌2型HA9801株基因组DNA模板的阳性对照、马链球菌兽疫亚种ATCC35246和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板的阴性对照。扩增条件为:94.C预变性5min;940C30 s , 55.C30 s , 720C40 5，30个循环;72.C延伸7min，40C保存。4.4.3 琼脂糖提股电泳在电泳缓冲液中加入1%琼脂糖，加热融化后加入澳化乙键制备凝胶，凝固后进行电泳。8L酶切产物加入2L5X上样缓冲液，t昆匀后加入上样孔，80V恒压电泳20min，紫外线透射检测。5 结果及判断5. 1 试验结果成立条件阳
7、性对照HA9801株经PCR扩增出现约858bp、387bp和316bp三条条带，去离子水的空白对照、马链球菌兽疫亚种ATCC35246和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板的阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立，否则，结果不成立。5.2 结果判断琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线投射下检测，在空白和阴、阳性对照成立的情况下，待检样品只出现387 bp一条条带，可判定为猪链球菌2型F待检样品出现约387bp、316bp和858bp三条条带，或出现387 bp和858bp两条条带，可判定为猪链球菌2型致病菌株;待检样品只出现858bp一条条带，可判定为非猪链球菌2型的致病菌;待检
8、样品不出现条带，结果为阴性。6 废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。2 mCON-叮-mFFH阁。华人民共和国家标准猪链球菌2型三重PCR检测方法GB/T 19915.4-2005 国中峰中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销峰印张0.5字数5千字2005年12月第一次印刷开本880X12301/16 2005年12月第一版定价8.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533唔书号:155066 1-26803
