1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1699. 1-2006 猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程Protocol of micro-serum neutralization test for porcine epidemic diarrhea 2006翩。1-26发布EE- | EE-噩啤啤呻呻OSB-BEE-& 川川川门门川门川-LEt-呻啤叫山山MAU刷刷刷副剧副剧创EEnul呻呻叫山川MMMHnu剧咄咄阳山阳刚刚配疗i( EE-znhu 门川门门川门川Hnu- ,EE- EE-EEE-B E-E圃i EE-ZEE- 施一实户OeeeE no nu 户。nu nu飞句/4e吨予
2、. : , . 营、w幽中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局前言SN/T 1699分为三部分:一一猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程;一一猪流行性腹泻病毒直接免疫荧光试验操作规程;一一猪流行性腹泻间接斑点酶联免疫吸附试验操作规程。本部分为SN/T1699的第1部分。SN/T 1699.1-2006 本部分参照国际动物卫生组织COIE)的标准诊断方法和疫苗标准手册)，2004年第五艇，并参考中华人民共和国进出境动物检疫规程手册制定。本部分的附录A为规琼性附录。本部分由嚣家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本部分起草人z罗长保、林志雄、朱
3、道中、颜思通。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。J SN/T 1699.1 2006 1 范围猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程SN/T 1699的本部分规定士猪流行性腹泻微量血清中和试验操作技术要求。本部分适用于猪流行性腹泻微量血清中和抗体检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1699的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。、凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法3
4、设备和材料3. 1 猪流行性腹泻病毒株:巳适应于传代细胞生长的猪流行性腹泻病毒PEDV-G1毒株。3.2 猪流行性腹泻阳性对照血清。3.3 猪流行性腹泻阴性对照血清。3.4 细胞:PK.:15传代结胞。3.5 96孔微量细跑培养板。3.6 微量移液器。3. 7 被检血清。3.8 细胞培养液CEargles MEM) 0 3.9 本标准所用水应符合GB/T6682中二级水的规格。4 操作方法4. 1 病毒增殖在PK15细胞形成单层后倒掉培养液，将病毒液接种到单层细胞上，摇匀后置37C5%二氧化碳培养箱股附1h，吸附期间摇匀一次，然后加入含5%棋牛血清细胞培养液CEargles MEM)。每天观察
5、细胞病CCPE)，CPE达到75%95%时收获。反复冻融三次后分装，置一700C保存，待测定毒价后使用。4.2 毒价测定在96孔微量板每孔加入50L培养液，将上述病毒液周培养液按10倍递减法在另外的容器内稀释成10-110-8个稀释度。用移被器将每一稀释度的病毒液分别移入8个孔内，每孔50Lo将培养好的P孔15细胞制备成20X 104 /mL30 X 104 /mL的悬液，在每个试验孔内加100L，每孔总蠢为200L另设不加病毒液的8个细胞孔作为对照，用50L培养被代替病毒液。置370C5.%工氧化联培养箱中培养72h，每天观察CPE，72h判定结果。毒价i血!定:用Karber氏方法测定50
6、%细胞病变滴度(TCID50)，见附录A。4.3 血清处理560C水浴箱内灭活30mino 1 SN/T 1699.1 2006 4.4 中和试瞌4.4. 1 稀释液眉立arglesMEM作为血清和病毒的稀释跤，各试验孔内加入50L稀释液。4.4.2 血清稀释将被检血清从1: 4稀释至1: 64，每个稀释度作3孔，每孔如各稀辑度血清50L，第一孔作为血清毒性对照，第工、王孔为正式实验孔。病毒自归试验和其他各项对照可用另一块微量板操作。4.4.3 加病毒夜将稀释好每50L均匀。血清毒性对照4.4.4 加细胞被4.4.5 对照对照孔的有关操作可按试验孔的阴性血清对照:4孔8陆性血清对照:4孔4.5
7、 病蕃吕归试验将工作病毒稀释成。每个稀释度8个孔，0.1个TCIDso，应全部不出现CPEo5 结果判定5. 1 在对照成立情况下判5.2 细胞对照:细胞生5.3 阴性血清对照:如5. 4 lEl性血清对照:不5.5 病毒因如试验z所得工作浓度适合时，5.6 被检血清z记下每度。如果被检血请在13意做仍可疑可判为阳性。2 对照孔之外的各孔内，振荡养箱内中和1ho L加入中和完毕的各试验般在72h终判。四个稀释度。出现CPE，l个TCIDso应有2个6个孔出现CPE，所有对照成立，病毒回归高血清稀释度作为终点滴为可疑。如发现可疑章做，附录A(规范性附录)主善价测定用Karber民方法摆II定50
8、%细胞病变滴度(TCID5o)，计算见式(A.l)。2:.T50 = t*十/:;.t式中zf一一接种孔出现100%CPE的最高病毒稀释度;/:;.t-町用接种孔数跺f和f以上感染孔数之和再减去1/2(50%)。举例1: 稀释度:10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10 读数:8/88/8 8/8 8/8 8/8 8/8 4/8 0/8 上倒10代表100%有CPE出现的最高病毒稀释度，即为f。a) t*=6.0 SN/T 1699.1-2006 .( A.1 ) 上倒/:;.t则是用接种孔数8除f感染孔数和f以上感染孔数之和再减去1/250%，即为50%终点
9、四子。b) /:;.t口(8十的/8-4/8=1.0 代人式(A.l): 2:.T50=t*十/:;.t立T50=6.。十1.0=7.。即:TCID50口10-7如用100TCID5o，可用100除2:.T50测定的滴度10-7得出10-5，即将原病毒被以10倍稀释。80NiFdmFH军中华人民共和国出入摸检验检疫行业标准猪流行性腹泻微量血语中和试验操作规程SN/T 1699.1-2006 争夺中国标准出版社出版北京复兴门外三星河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷品，、开本880X 1230 1/16 印张0.5字数7千字2006年4月第一版2006年4月第一次印刷印数1-2000号寺书号:155066 2-16753 定价6.00元SN/T 1699.1 2006
