1、GB/T 18204. 3-2000 前言为贯彻执行公共场所卫生管理条例和GB96639673-1996.GB 16153-1996公共场所卫生标准.加强对公共场所卫生监督管理，特制定本标准e本标准中的方法是与GB96639673-1996. GB 16153-1996相配套的监测检验方法。本标准第一法为仲裁法.本标准为首次发布。本标准由中华人民共和国卫生部提出.本标准起草单位:江苏省卫生防疫站、中国预防医学科学院环境卫生监测所、北京市卫生防疫站.本标准主要起草人2封幼玲、符晓梅、杭万双、周淑玉、高睬。中华人民共和国国家标准公共场所茶具微生物检验方法大肠菌群测定Methods of micro
2、biological examination for tea set in public places -Determination of Co /iform bacteria 1 范围本标准规定了公共场所茶具大肠茵群的测定方法。本标准适用于公共场所内公用茶具大肠菌群的测定。2 定义本标准采用下列定义.大肠菌群coli/orm bacteria GB/T 18204. 3-2000 指一群在3TC、24h 培养能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰民阴性无芽胞杆菌.该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价被检物的卫生质量。3 仪器3. 1 高压蒸汽灭菌器。3. 2 干热灭菌箱
3、.3.3 培养箱:36C士IC.3. 4 水箱。3- 5 电炉.3.6 天平.3.7 灭菌平皿:直径9cmo3. 8 灭菌刻度吸管:1mL.I0 mL。3. 9 灭菌棉拭子。3. 10 灭茵剪刀.3.11 pH计或精密pH试纸。4 培养基和试剂4. 1 乳糖胆盐发酵培养液4. 1. 1 成分2蛋白陈20 g 猪胆盐(或牛、羊胆盐)5 g 乳糖10 g 0.04%漠甲盼紫水溶液25 mL 蒸惚水1000 mL 国家质量技术监督局却00-09-30批准2001 - 01 -01实施9 GB/T 18204.3-2000 4. 1. 2 制法g将蛋白陈、胆盐及军L糖溶于蒸馆水中，调pH至7.4.加澳
4、甲盼紫榕液，混匀，分装到带有倒管的试管中，每管10mL。以l1SC高压灭菌15min。注2双料乳糖胆盐发醉管除蒸馆水外，其他成分加倍.4.2 伊红美蓝琼脂4. 2. 1 成分2蛋白陈10 g 乳精10 g 磷酸氨二号甲2 g 琼腊17 g 2%伊红水溶液20 mL 0.65%美蓝溶液10 mL 蒸馆水1 000 mL 4.2.2 制法:将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于蒸饱水中，调pH至7.1.分装到烧瓶内。121C高压灭菌15 min备用，临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55C.加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板.4.3 乳糖发酵管4. 3. 1 成分:蛋白陈20 g 乳糖10 g 0.0
5、4%澳甲酌紫水浴液25 mL 蒸馆水1 000 mL 4.3.2 制法z将蛋白炼及乳糖浓于水中，调pH至7.4.加入指示剂，分装到带有1J管试管中，每管3 mL.115C高压灭菌15min. 4.4 革兰氏染色液4. 4. 1 结晶紫染色液z结晶货1 g 95%乙醇20 mL 1%草酸钱水溶液80 mL 将结晶紫溶于乙静中，然后与草酸镀济液混合。4.4.2 革兰氏破液:殃E典化何1 g 2g 蒸馆水300 mL 将破与破化仰先进行混合.加入蒸缩水少i午，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸饱水至300mL. 4.4.3 脱色液z95%乙醇4.4.4 沙黄复染液z沙黄95%乙那蒸馆水gLL Mmm U
6、UnutAQU 将沙黄辩解于乙醇中，然后用蒸饿水稀释.4.5 染色法4. 5. 1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1min，水洗.4.5.2 滴加革兰氏腆液，作用1mn，水洗.4. 5. 3 滴加95%乙醇脱色，约30s，水洗。4.5.4 滴加复杂液，复染lmin.水洗，待干，镜检.10 一GB/T , 8204.3 -20 4.6 染色结果革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色.4.7 大肠菌群快速检验纸片4. 7. , 质量要求z纸片必须符合食(饮具用大肠菌群快速检验纸片质量标准.4.7.2 质量标准:每张纸片5cmX5 cm.pH值7.0-7.4.包装元菌，生产厂家经卫生部门
7、审核认可.5 检验程序大肠菌群检验程序如下z不产酣.不产气大肠菌醉阴性报告位样握绍盟料乳糖阻盐世酵曹36:引:一革兰氏J!色产融、产气伊虹吏蓝琼脑平缸36古8-24h乳精监醉管36 C土1巳12.h 革兰氏阳性革兰民阴性主芽胞杆菌产由、产气不产酣、不产气大岛西群阴性大E菌群阴性大筋菌群阳性月报告捆f号6 操作步骤6. , 采样方法6. ,. , 随机法g随机抽取消洗消毒后准备使用的茶具.6. .2 涂抹法=使用测定细菌总数时采集的样品，无需重采.6. ,. 3 纸片法=用灭菌生理盐水湿润5cmX5 cm大肠菌群快速测定纸片两张，分别粘贴在茶具内、外缘口唇按触处，约30s后取下，置于元前塑料袋内
8、.6.2 检验方法6. 2. , 万群法6.2. 用测定细菌总数剩余的检样，倒人双料乳糖胆盐发酵培养液中.景36C土lC培养箱内培养24 h. 6.2.2 观察是否产酸、产气，若有变黄和气体产生，该管推测性检验阳性.6.2.3 如不产酸、不产气则为大肠菌群阴性.6.2. .4 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，转种伊红美蓝琼脂平板上，置36C士IC培养箱培养18-24h.然后取出，观察菌落形态，并做萃兰氏染色和证实性试验a11 GB/T 18204.3-2000 6.2.1.5 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行染色镜检5同时接种乳糖发酵管，置36C土1C培养24h. 6.2.2 纸片法将已采样的纸片置36C士1C培养箱内培养16-18h.观察结果.7 结果报告7. 1 发酵法凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的元芽胞杆菌，即可报告检出大肠菌群。7.2纸片法纸片保持紫蓝色不变，则报告为大肠菌群阴性;纸片变黄，并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕，则报告检出大肠菌群。12 C_一一一一一
