1、ICS 11220B 41N Y中华人民共和国农业行业标准NYT 772-2004禽流感病毒RTPCR试验方法2004-02-17发布 20040217实施中华人民共和国农业部发布刖 舌本标准由中华人民共和国农业部提出。，本标准由全国动物榆疫标准化技术委员会归口。本标准推荐r两种试验方法。本标准中附录A、附录C为规范性附录，附录B、附录I)为资料性附录。本标准起草单位：一l围农业科学院哈尔滨兽医研究所、农业部兽医诊断中心本标准主要起草人：王秀荣、孙明、刘明、f宏伟、陈化气刘丽玲。NYT 7722004禽流感病毒RT-PCR试验方法(一)NYT 77220041范围本标准规定了禽流感病毒型特异性
2、检测技术和禽流感病毒H5、H7、H9 jIIL凝素亚型及N1、N2神经氨酸酶亚型的RTPCR鉴别技术。本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸。，2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究足否可使用这砦文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 18936高致病性禽流感诊断技术3实验室条件3 1仪器：PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、手提紫外线灯、紫外凝胶成像仪、微量移液器、
3、水浴箱等。3 2从事RT PCR_作的实验室尽可能分区，根据条件划分出RNA提取区、基因扩增区、电泳。特别注意电泳后的琼脂糖凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。3 3注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB可诱发基因突变，试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并通过焚烧进行无害化处理。4试剂的准备4 1试剂4 1 1变性液见A1。4 1 2 2 M醋酸钠溶液(pH 40)见A2。4 1 3水饱和酚(pH 40)。41 4氯仿异戊醇混合液见A3。415 M MLV反转录酶(200 utzI，)。4 1 6 RNA酶抑制剂(40 u儿I。)。417 7laq DNA聚合酶(5 u几I。)。418
4、 10琼脂糖凝胶见A4。419 50xTAE缓冲液见A5。4 110溴化乙锭(10 pg乍L)见A6。4111加样缓冲液见A7。4 1 12焦碳酸二乙酯(I)EPC)处理的灭菌双蒸水见A8。4 1 13 5反转录反应缓冲液见A9。41 14 25mmodN，I如见A10。4 115 10PCR Burfer见A11。】NYT 7722D044116 DNA分子量标准。42引物见附录Bo5操作程序5 1样品的采集和处理按照GBT 18936中提供的方法进行。52 RNA的提取521设立阳性样品对照、阴性样品对照。522异硫氰酸胍一步法5221将组织或细胞中加入适量的变性液，匀浆。52 2 2将混
5、合物移至一管中，按每毫升变性液中立即加入01mL乙酸钠、1 mI。酚、02mL氯仿异戊醇混合液。加入每种组分后，盖上管盖，倒置混匀。5223将匀浆剧烈振荡10 S，冰浴15min，使核蛋白质复合体彻底裂解。5 224然后12 000 rpm，4C离心20 rain，将上层含RNA的水相移人一新管中。为了降低被处于水相和有机相分界处的DNA污染的可能性，不要吸取水相的最下层。5 2 2 5加入等体积的异丙醇，充分混匀液体，并在一20条件下沉淀RNA l h或更长时间。5226 412 000 rpm离心10min，弃上清，再用75的乙醇洗涤沉淀；然后离心，再用吸头彻底吸弃上清，在自然条件下干燥沉
6、淀，溶于适量DEPC处理的水中。一20贮存，备用。523选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA的提取。5 3反转录531取5”L RNA，加1 pL反转录引物，705 min。5 32冰浴2rain。533继续加入：5反转录反应缓冲液4“LO1MDrr 2“L25mmo|dNTPs 2 uLMMLV反转录酶05nLRNA酶抑制剂05“LDEPC水 11”L37*(2水浴1 h，合成cDNA链。取出后，可以直接进行PCR，或者放于2012保存备用。试验中同时设立阳性对照和阴性对照。5 4 PCR根据扩增目的的不同，选择不同的上、下游引物M一229UM一229L是型特异性引物，用于扩增禽流感病
7、毒的M基因片段；H5380UH5 380L、H7501UH7501L、H9732UH9732L分别特异性扩增H5、H7、H9亚型血凝素基因片段；N1358UN1358L、N2377UN2377L分别特异性扩增N1、N2亚型神经氨酸酶基因片段。PCR为50“L体系，包括：双蒸灭菌水 375“L反转录产物 4“I，上游引物05“L2NYT 7722004下游引物05“L10PCRBuffer 5“L25mmol dNTPs 2“LTaq酶05”L首先加入双蒸灭菌水，然后再按照顺序逐一加入上述成分，每一次要加入到液面以下。全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。在每个PCR管中加入l滴
8、液体石蜡(约20止)。循环参数为95*(25 min，94*(2 45 s，52*(2 45 s，72C 45 s，循环30次，72*(2延伸6 min结束。设立阳性对照和阴性对照。55电泳551制备1O琼脂糖凝胶板，见A4。552取5止PCR产物，与05止加样缓冲液混合，加人琼脂糖凝胶板的加样孔中。553加入分子量标准。554盖好电泳仪，插好电极，5 Vcm电压电泳，30 rain-40 min。5 55在手提紫外线灯下观察；或者用紫外凝胶成像仪扫描图片存档，打印。5 56用分子量标准比较，判断PCR片段大小。6结果判定61在阳性对照出现相应大小扩增带、阴性对照无此带出现的情况下判定结果。6
9、2用M一229UAVI一229L检测，出现大小约229 bp扩增片段时，判定为禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。63用H5380UH5380L检测，出现大小约380 bp扩增片段时，判定为H5血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。64用H7501UH7501L检测，出现大小约501 bp扩增片段时，判定为H7血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。65用H9732UH9732L检测，出现大小约732 bp扩增片段时，判定为H9血凝紊亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。66用NI一358UN1358L检测，出现大小约358 bp扩增片段时，判定为N1神经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴
10、性。67用N2377UN2377I。检测，出现大小约377 bp扩增片段时，判定为N2神经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。3NYT 7722004禽流感病毒RTPCR试验方法(二)1范围本标准规定了禽流感病毒型特异性检测技术和禽流感病毒H5、H7、H9血凝素亚型的反转录聚合酶链反应(RTPCR)鉴别诊断技术。本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸。2试剂21变性液见C1。22 2 molL醋酸钠溶液(pH4O)见C2。2 3酚氯仿异戊醇混合液见C3。2 4 25 mmolL dNTP见C4。25 10PcR缓冲液见C5。26溴化乙锭(EB)溶液见C6。27
11、 7l?AE电泳缓冲液见C7。28 2琼脂糖凝胶见C8。2 9上样缓冲液见C9。210 10 pmolt,LRTPCR引物见附录D。2 11其他试剂：5“TaqDNA聚合酶，10,otLLAMV反转录酶，40 p乍L，RNA酶抑制剂，异丙醇，70乙醇。3实验室条件31实验室应配备的仪器分析天平、台式冷冻高速离心机、真空干燥器、制冰机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮罐或一70C冰箱、微波炉、组织研磨器、一20C冰箱、可调移液器(2 gI。、20tLL、200 tLL、1 000“L)。3 2实验室分区PCR整个试验分PCR反应液配制区配液区、模板提取区、扩增区
12、、电泳区。流程顺序为配液区一模板提取区一扩增区一电泳区。严禁器材和试剂倒流。4操作程序4 1样品的采集及处理411样品的采集病死或扑杀禽，取脑、肺等组织；待检活禽，用棉拭子蘸取气管分泌物或泄殖腔排泄物，放于50甘油生理盐水中(要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料)。4 1 2样品的处理4121组织样品处理称取待检病料005 g，置于研磨器中剪碎并研磨，?JnA600 f-I。变性液继续研磨。取已研磨好的待4NYT 7722004检病料上清300“L，置于15 mL灭菌离心管中，加入100 pI。变性液，混匀。4 122分泌物和排泄物样品处理将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子。4C 8 000 rp
13、m离心5 min，取上清100止，置于15 mI灭菌离心管中，加人300止变性液，混匀。4123阳性对照处理取禽流感病毒液100”L，置于15mL灭菌离心管中，加入300止变性液，混匀。412 4阴性对照处理取灭菌双蒸水100“L，置于15 mL灭菌离心管中，加入300tzL变性液，混匀。4 2病毒RNA的提取421取已处理的待检样品以及阴性对照、阳性对照。每管依次加入醋酸钠溶液30 pL、酚氯仿异戊醇混合液300 btL，颠倒10次混匀，冰浴15 min，4C 10 000 rpm离心15 rain。4 22取上清300“L置于新的经DEPC水处理过的15 rnL灭菌离心管中，加入等体积异丙
14、醇，混匀，置于液氮中3min或700C冰箱20min。取出样品管，室温融化，4C 15 000 rpm离心20rain。4 23弃上清，沿管壁缓缓滴入1 mL 70乙醇，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1rain，真空干燥15min。424用10止无RNA酶的灭菌双蒸水和1 pLRNA酶抑制剂溶解沉淀。一20储存备用。43 l一PCR431引物选用43 11型特异性引物用于检测禽流感病毒核蛋白基因(NV)片段。4312 1-15亚型引物用于检测禽流感病毒H5亚型血凝素基因(HA)片段。43 13 I-17亚型引物用于检测禽流感病毒H7亚型血凝素基因(HA)片段。4314 H9亚型引
15、物用于检测禽流感病毒H9亚型血凝素基因(HA)片段。432反应体系本试验为反转录和PCR扩增同时进行，反应液总体积为25 pI。DEPC处理的灭菌双蒸水 13“I。25 mmolL dNlP 25IL10 pmoluLRTPCR；1物 15_I上L15 mmolL氯化镁 2”L10PCR缓冲液 25pI。AMV反转录酶02止RNA酶抑制剂03pL，5u TaqDNA聚合酶 1zL提取的样品RNA 2“L混匀并做好标记，加入20止矿物油覆盖，在PCR扩增仪上进行以下循环：42C 45 min，95V2 3rain；扩增条件为95C 30 S，5040 s(用型特异性引物时，为55C 40 S)，
16、72C 40 s，35个循环后，72E延伸10rain。44电泳取PCR扩增产物15pL与3 pL上样缓冲液混合，点样于2琼脂糖凝胶孔中，以5Vcm电压进行电泳，40 min，紫外凝胶成像仪或紫外分析仪上观察结果。5结果判定5 1 在阳性对照出现相应大小扩增带、阴性对照无带此出现的情况下判定结果。5NYT 77220045 2用型特异引物检测被检样品出现330 bp条带时，判定为禽流感病毒阳性，否则为阴性。53用H5亚型引物检测被检样品出现545 bp条带时，判定为H5亚型禽流感病毒阳性，否则为阴性。54用H7亚型引物检测被检样品出现634 bp条带时，判定为H7亚型禽流感病毒阳性，否则为阴性
17、。55用H9亚型引物检测被检样品出现488 bp条带时，判定为H9亚型禽流感病毒阳性，否则为阴性。6A 1变性液附录A(规范性附录)相关试剂的配制NYT 77220044M异硫氰酸胍25 mM柠檬酸钠2H2005(mv)十二烷基肌酸钠01M B一巯基乙醇具体配制：将250 g异硫氰酸胍、075M(pH 70)柠檬酸钠176mL和264mLl0(mV)十二烷基肌酸钠溶于293mL水中。65*(2条件下搅拌、混匀，直至完全溶解。室温条件下保存，每次l临用前按每50mL变性液加入144molL的B一巯基乙醇036mL的剂量加入。变性液可在室温下避光保存数月。A 2 2 molL乙酸钠溶液(pH40)
18、乙酸钠冰乙酸灭菌双蒸水A 3氯仿异戊醇混合液氯仿异戊醇A 4 1 0琼脂糖凝胶的配制164 g调pH至40加至100mL49 mL1 mL琼脂糖 10 g05TAE电泳缓冲液 加至100 n1L微波炉中完全融化，待冷至50-60C时，加溴化乙锭(EB)溶液5,uL，摇匀，倒人电泳板上，凝固后取下梳子，备用。A 5 50XTAE电泳缓冲液A 5 1 0 5 molL乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8 0l二水乙二铵四乙酸二钠灭菌双蒸水氢氧化钠灭菌双蒸水A 5 2 TAE电泳缓冲液(50X)配制羟基甲基氨基甲烷(Tris)冰乙酸05 molL乙二铵四乙酸二钠溶液(pH80)灭菌双蒸水1861
19、 g80 mL调pH至80加至100 H山242 g571mL100mL加至1 000mL7NYT 7722004用时用灭菌双蒸水稀释使用。A 6澳化乙锭(EB)溶液溴化乙锭灭菌双蒸水A7 10加样缓冲液聚蔗糖灭菌双蒸水溴酚蓝二甲苯腈A 8 DEPC水超纯水焦碳酸二乙酯(DEPc)室温过夜，121高压15 min，分装到1A 9 MMLV反转录酶5反应缓冲液1tooL TrisHCI(pH 83)KaMgChDTT灭菌双蒸水A10 25 nunolL dNTPDATP(10 mmol2。)T胛P(10mmol几)I)(汀P(10 mmolL)DCrP(10 mmolL)A11 10PCR缓冲液
20、1M TrisHCl(pH88)1 M KClNonidet P4015tooLMgCl2灭菌双蒸水820 mg加至20mL25 g100mL01 g01 g100mL50“I。5 mL DEPC处理过的微量管中。5 mL0559 g0029 g0154 g加至100mL20 ul。20“L20 uL20“L10 mL50 mL08 mL1 mL加至100mL附录B(资料性附录)禽流感病毒RTPCR试验用引物B 1反转录引物Uni 12：5一A(x：AAAAGCAGG一3，引物浓度为20 pmol。B2 PER引物见表B1，引物浓度均为20 pmol。表B 1 PCR过程中选择的引物NYT 7
21、72-2004长度引物名称 引物序列 扩增目的bpM一229U 5 7一TnlAAo咒A(_=(订GAAAC 3229 通用引物M一229L 5一AA(-；CGr(AaXlGCAGJIC一35 380U 5一AtIGAATT疆；AATATGGTAA3380 H5 380L 5j AACTGAGIrGTTCATRTIUK：31-17 501U 5 AATGCACARGGAGGA(；GAACT一3501 mH7 501L 5TGAY(XXXXX；A恕AAAOCA一3H9 732U 5一TCAACAAA【瓢CACCGAAA(湘T一3732 H9H9 732L 5_-TC0c(H、AAGAACA2L7
22、1C(ATA【X认一3N1 358U 5ATTRAAATA【mYCGYATAArAAC 3358 NINl一358L 5GIEWCCGAAAACY(YJACrGCA一3N2 377U 5(jTGWYATAGCAIX3GTCCAGCTCAAG一3377 N2N2 377L 5 GA(舰YrH二CAImG砌TGCn一3注：W=(AT)；Y=(了)；R=(AG)。9NYT 7722004c 1变性液C 2C3柠檬酸钠十二烷基肌氨酸钠B一巯基乙醇硫氰酸胍灭菌双蒸水2 molL乙酸钠溶液(pH40)乙酸钠冰乙酸灭菌双蒸水酚氯仿异戊醇混合液酸性酚氯仿异戊醇C 4 2 5mmolLdNIPdATP(100
23、mmolL)dTTP(100 mmolL)dGTP(100 mmol厂L)dCTP(100 mmolL)灭菌双蒸水C 5 10PCR缓冲液灭菌双蒸水三羟甲基氨基甲烷(Tris)氯化钾曲拉通x一100盐酸灭菌双蒸水c 6澳化乙锭EB)溶液溴化乙锭灭菌双蒸水附录C规范性附录)试剂的配制c 7 TAE电泳缓冲液(50)c 7 1 05molL乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH 8 0)100764 g05 g0868mL4728 g加至100mI。164 gpH至40加至100mL50 mL49ml。1 mL20“I，20 u1。20 uI20 uL加至800“L70mL0158 g0373 g
24、01mL调pH至90加至100mL02 g加至20mL二水乙二铵四乙酸二钠灭菌双蒸水氢氧化钠灭菌双蒸水c 7 2 TAE电泳缓冲液(50X)配制三羟甲基氨基甲烷(Tris)冰乙酸05 molL乙二铵四乙酸二钠溶液(pH80)灭菌双蒸水用时用灭菌双蒸水稀释使用。C8 2琼脂糖凝胶的配制琼脂糖TAE电泳缓冲液(50)灭菌双蒸水微波炉中完全融化，加溴化乙锭(EB)溶液50止。C，9上样缓冲液1861 g80 mL调pH至80加至100mL2429571mL100mL加至1 000mL4 g4mL196mLNYT 772_2004溴酚蓝02 g，加双蒸水10 mL过夜溶解。50 g蔗糖加入50 mL水
25、溶解后，移人已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至100 mL。NYT 7722004附录D资料性附录)禽流感病毒I盯一PCR试验用引物D 1 10 pmolmL型特异性引物配制2 OD的上游型特异性引物加灭菌双蒸水至462“L，2 OD的下游特异性引物加灭菌双蒸水至445“I。使用时，2种引物等体积混匀即可。D 2 10 pmolmLH5亚型引物配制2 013的上游H5亚型引物加灭菌双蒸水至494 m。，2013的下游H5亚型引物加灭菌双蒸水至484“L。使用时，2种引物等体积混匀即可。D 3 10pmol仉LIl7亚型引物配制2 OD的上游H7亚型引物加灭菌双蒸水至487”L，2 OD的下游H7
26、亚型引物加灭菌双蒸水至488“L。使用时，2种引物等体积混匀即可。D 4 10 pmol仙Lm亚型引物配制3 OD的上游H9亚型引物加灭菌双蒸水至492,uL，2 OD的下游H9亚型引物加灭菌双蒸水至516HL。使用时，2种引物等体积混匀即可。袭D 1引物名称 序 列 扩增片段大小 扩增片段位置 用途上游型特异性引物 5一CAGRTACILX；(7CHATAAGRAC 3 330 bp 核蛋白基因 禽流感病毒下游型特异性引物： 5。一(肼rIX；IC1WAAGAAATAAG 3 1 2001 529 型鉴定上游H5亚型引物 S一啦删ea鼢瓯狐啦t 3 545 bp 血凝紊基因 禽流感病毒下游H5亚型引物 5一CrmRrn，A(：TGTTGATGT一3 155699 H5亚型鉴定上游H7亚型引物 5+一(XX；A，rA(AAAATGAAYA【jII：一3 634 bp 血凝素基因 禽流感病毒下游H7亚型引物 5一CC“r钻mYy-11“7r(riGYTC 3 12645 H7亚型鉴定上游H9亚型引物 s_吼眈AcAc敞；AGCAYAATGG 3 488 bp 血凝素基因 禽流感病毒下游H9亚型引物 5一GYACACTTGTTGTTGTRTC一3 15l638 H9亚型鉴定注：Y=CT R=AG H=A(2r B=Gt22。
