1、ICS 65120B 46中华人民共和国国家标准农业部1068号公告一4200820080725发布饲料中氯米芬的测定高效液相色谱法Determination of clomiphene in feedsHjghperformance liquid chromatography2008-0725实施中华人民共和国农业部发布刖 昌农业部1 068号公告一42008本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心(济南)、中国农业科学院饲料研究所、河北省饲料监察所。本标准主要起草人：战余铭
2、、朱良智、汤文利、孙延军、杨智国、李桂华、张萍、李文香、陈宝明、刘庆贤。1范围饲料中氯米芬的测定高效液相色谱法农业部1 068号公告一42008本标准规定了配合饲料中氯米芬的高效液相色谱测定方法。本标准适用于配合饲料中氯米芬的测定。本方法最低定量限为：反式氯米芬03 ragkg，顺式氯米芬05 ragkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实
3、验室用水规格和试验方法GBT 146991饲料采样GBT 20195动物饲料试样的制备3方法原理配合饲料中氯米芬用甲醇提取，提取液离心后过混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱液吹干后用甲醇溶解，在高效液相色谱仪上分离，紫外检测器233 nm处测定，用二极管阵列检测器确证。外标法定量。4试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水符合GBT 6682中一级水的规定。41甲醇：色谱纯。4 2氨水。4 3乙酸。44磷酸：色谱纯。4 5三乙胺：色谱纯。4 6 2乙酸溶液：取乙酸(43)2 mL，于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。47 5氨化甲醇溶液：取氨水(42)6
4、 mL，于100 mL容量瓶中，用甲醇(41)定容至刻度，摇匀。4 8固相萃取小柱：混合型阳离子交换柱，6 mL(150 mg)，或其他性能类似的小柱。49磷酸溶液：c(H。PO。)一2 m01L。4 10磷酸溶液：c(H。P04)-0035 molL。取磷酸溶液(49)176 mI。，加水至1 000 mL，摇匀。4 11流动相：甲醇+磷酸溶液(410)一75+25。混匀，用三乙胺(45)调pH至75士01，过022 pm有机滤膜。4 12枸橼酸氯米芬混合对照品：纯度99，反式枸橼酸氯米芬+顺式枸橼酸氯米芬一38+62。或其他比例的枸橼酸氯米芬混合对照品。1农业部106B号公告一420084
5、 13混合标准贮备液：精确称取枸橼酸氯米芬对照品(412)50mg(精确到01mg)，置50mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，其枸橼酸氯米芬的浓度为1 mgmL。于4冰箱内冷藏贮存，有效期6个月。4 14混合标准中间液：准确吸取称混合标准贮备液(413)500mL，于50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，其枸橼酸氯米芬的浓度为100 pgmL。于4C冰箱内贮存，有效期1个月。4 15混合标准T：作液：准确吸取适量的混合标准中间液(414)于棕色容量瓶中，用甲醇稀释成枸橼酸氯米芬浓度为05 pgmL、25 pgmL、5 pgmL、10#gmL、25 pgmL标准工作液。于4冰箱内冷藏贮
6、存，有效期1周。416氮气：纯度9999。417滤膜：o22“m，有机相。5仪器和设备5 1实验室常用仪器设备。52高效液相色谱仪：具有C。s柱，紫外检测器及二极管阵列检测器。5 3离心机：转速4 000 rrain。54固相萃取装置。5 5涡旋混合器。5 6超声波清洗器。5 7分析天平：感量01mg。5 8氮吹仪，可控温至40。5 9酸度计。5。10移液器：量程100弘Ll 000 pL。6试样制备按GBT 146991采样。选取有代表性饲料样品至少500 g，按GBT 20195制备样品。7测定步骤7 1提取称取试料约5 g，精确至01mg，置于100mL塑料离心管中，准确加入甲醇(41)
7、25mL，涡旋混合器提取1min 2次，于5 000 rrain下离心15rain。转移上清液于具塞试管中。再准确添加25mL甲醇，重复上述操作，合并2次上清液，涡旋混匀，备用。7 2净化依次用甲醇(4I)6 mL、水5 mL活化阳离子交换固相萃取柱(48)。准确移取上述试液1000 mI一上柱，液体的过柱速度控制在1mLrain以内。并依次用2乙酸溶液(46)5mL、甲醇(41)5mL淋洗柱子，用5氢化甲醇溶液(47)5mL洗脱，收集洗脱液，40|。C氮气吹干。准确加入甲醇(4。I)100mL溶解残留物，涡旋30 S，过022 tzm的滤膜，上机测定。7 3液相色谱条件色谱柱：C。柱，250
8、mmX 46mm，粒径5,um，或具同等性能的色谱柱。柱温：室温。检测器：二极管阵列检测器和紫外检测器。检测波长：233 nm。农业部1068号公告42008扫描范围：210 nm400 itm。流动相：甲醇+磷酸溶液gmL)5v。加入提取液的体积的数值，单位为毫升(mL)；yz加入甲醇溶解的体积的数值，单位为毫升(mL)；砜移取提取液上固相萃取小柱的体积的数值，单位为毫升(mL)；N。标准对照品中顺式枸橼酸氯米芬的百分含量的数值；N：标准对照品中反式枸橼酸氯米芬的百分含量的数值；m试料称取质量，单位为克(g)。计算结果保留3位有效数字。9重复性在同一实验室、由同一操作人员完成的2个平行测定结果，相对偏差不大于lO，以2次平行测定结果的算术平均值为测定结果。农业部1068号公告一42008附录A(资料性附录)顺反式氯米芬特征光谱图和混合标准样品图谱A1 100“gmL顺反式氯米芬混合标准样品图谱(出峰顺序依次为反式氯米芬、顺式氯米芬)见图A1。图A 1 100斗mL顺反式氯米芬混合标准样品图谱A 2反式氯米芬二级管阵列特征光谱图见图A2。图A 2反式氯米芬二级管阵列特征光谱图A 3顺式氯米芬二级管阵列特征光谱图见图A3。208642O8642086420怒糍糍酱船鼢端瓣农业部1068号公告一42008图A 3顺式氯米芬二级管阵列特征光谱图
