1、ICS 65.020.30 B 40 GB 中华人民=1:1工和国国家标准GB/T 25170-2010 畜禽基因组BAC文库构建与保存技术规程Technical regulation of farm animals genome BAC library construction and preservation 2010-09-26发布2011-03-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检痊总局中国国家标准化管理委员会发布目IJ1=1 本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会CSAC/TC274)归口。本标准起草单位:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。本
2、标准主要起草人:关伟军、马月辉、刘长青、潘春留、刘洪坤、甫亚斌、余露露。GB/T 25170一2010I GB/T 25170-2010 1 范围畜禽基因组BAC文库构建与保存技术规程本标准规定了畜禽基因组BAC文库构建方法。本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽的基因组BAC文库构建与保存。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB /T 6682 分
3、析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1 基因组文库genome Iibrary 用重组DNA技术将某种生物细胞的核DNA的全部片段随机地连接到载体上，再转移至适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集。3.2 细菌人工染色体bacterial artificial chromosome , BAC 以大肠杆菌致育因子为基础，利用现代重组DNA技术体外人工合成的具有容纳高分子量外源DNA的特性载体。3.3 DNA连接DNA Iigation 在DNA连接酶催化下，靶DNA片段与载体DNA相邻的5端磷酸与3端起基之间形成磷酸二醋键的过程。
4、3.4 感受态细胞competent cells 在特定条件下细胞膜通透性发生改变，允许外源DNA进入细胞内的特殊状态下的受体细胞。3.5 电转化electrotransformation 在高压脉冲的作用下，将外源DNA导人感受态细胞的过程。3.6 脉冲场凝股电泳pulse field gel electrophoresis , PFGE 利用脉冲场电泳系统电场方向周期性交替变化的功能而分离和鉴定生物大分子的技术。3. 7 重组体recombinant 两种以上不同来源的DNA片段连接所形成的杂种DNA分子。1 GB/T 25170-2010 4 试剂及溶液配制除另有规定外，试剂为分析纯或生
5、化试剂。实验用水要符合GB/T6682中一级水的要求。4.1 LB培养冻存缓冲液CIuria-bertanimedia) 360 mmol/L KzHP04, 13.2 mmol/L KHzP04 1. 7 mmol/L拧攘酸纳，O. 4 mmol/L MgS04, 6.8 mmol/L (NH4)zS04 , 4. 4%甘油，定容至100mL，应用时以冻存缓冲液与LB液体培养基1: 9的比例配制。4.2 5-滇-4-氯-3-用|睐-D-半乳糖苦贮存液(5-brom命4-chloro-3-indolyI-D-galactoside，X-gal) 用二甲基甲酷股溶解X-gal，配成20mg/mL
6、贮存液，-20t避光保存。4. 3 1 moI/L Tris-CI 12 1. 10 g/L Tris碱溶于800mL/L双蒸水(doubledistilled HzO，也lHzO)中，用HCl调pH至8.0，定容至1000 mL，高压灭菌。4.4 内切酶缓冲液10 mg/mL BSA，10X酶反应缓冲液，1mmol/L DTT, 1 mmol/L亚精肢。4.5 SOC培养基称取20.00g膜化蛋白陈，5.00g酵母提取物，0.50 g NaCl，量取2.5mL 1 mol/L KCl , 10 mL 2 mol/L MgS04或MgClz，溶于980mL ddHz 0，高压灭菌后冷却至60.
7、C以下，加入10mL 2 mol/L 葡萄糖溶液。4.6 异丙基硫代-阶b半乳糖昔溶波(isopropyIthio-庐D-galactoside，IPTG) 称取1.00 g IPTG溶于5.0mL双蒸水中，过滤除菌装成1mL/份，贮存于一20.C。4. 7 琼脂糖块储存液800 mL ddHzO中加入186.10 g乙二肢四乙酸二锅(ethylenediamine tetraacetic acid , EDT A) ，在磁力搅拌器上搅拌，调pH至8.0后，加ddHzO定容至1000 mL，高压灭菌。4.8 CsCI密度梯度离心纯化渡3.3 mL饱和CsCl，加灭菌石蜡油至总体积10mLo 4
8、.9 十二皖基肌氨酸铀摆冲液(N-DodecanoyI-N-methylglycine sodium salt, NDS) 称取186.00g EDTA和1.20 g Tris-Cl，溶于700mL ddHzO中，调pH至8.0，加入NDS调pH至9.5，用ddHzO定容至1L.过滤灭菌。4. 10 抗凝剂(拧攘酸纳葡萄糖液)称取0.48g拧棒酸、1.32 g拧棱酸铀、1.47 g葡萄糖，用ddHzO定容至100mL，高压灭菌。4. 11 氯毒素乙醇配制，工作浓度为12.5g/mL，-20.C保存。4.12 Tris(10 mmoI/L pH8. O)-EDTA( l. 0 mmoI/L pH
9、8. 0)缓冲液，TE10 mmol/L pH8. 0 Tris-Cl, 1. 0 mmol/L pH8. 0 EDTA，高压灭菌，室温保存。4.13 LB液体培养基称取10.00g细菌培养用膜蛋白陈、5.00g细菌培养用酵母提取物、10.00g NaCl溶于800mL ddHzO中，调pH至7.4，定容至1L，高压灭菌。4.14 LB固体培养基称取10.00g细菌培养用膜蛋白陈、5.00g细菌培养用酵母提取物、10.00 g NaCl，溶于800mL ddHzO中，调pH至7.4，加人15.00g细胞培养用琼脂，定容至1L，高压灭菌。4.15 含特定抗生素培养基按照4.14的方法配制好LB固
10、体培养基，高压灭菌后待其不烫手时，按2mL培养基:1L氯霉素(12.5g/mL)的比例添加氯霉素，倒20mL培养基于90mm培养板中。待培养基凝固后，将40LX-gal和7LIPTG混匀后，均匀涂于培养基表面，超净台里晾干备用。4.16 喊裂解液IG/T 25170-2010 50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L pH8. 0 Tris-Cl , 10 mmol/L pH8. 0 EDTA，定容至1L，高压灭菌，4 C保存。4.17 破裂解渡E0.2 mol/L NaOH , l% SDS，现用现配。4.18 碱裂解液E1. 32 mol/L乙酸甲，4C保存。5 主要仪器、设备水浴锅、电
11、热恒温鼓风干燥箱、培养箱、电子天平、一80C低温冰箱、超纯水仪、低温离心机、凝胶自动成像分析系统和脉冲电泳仪等。6 基因组AC文库构建6. 1 高分子量DNA制备6. 1. 1 细胞收集6. 1. 1. 1 家禽血细胞的收集采集3.0 mL5. 0 mL畜禽新鲜血液，立即注入含1mL肝素纳(500U/mL)或拧攘酸铀葡萄糖的离心管中抗凝。4.C下，4500g离心5min，弃上清，加入等体积预冷的pH7.0磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline , PBS) ，混匀。上述血细胞收集步骤重复离心3次后，加入1.0 mL PBS重悬细胞。重悬细胞后计数，将血细胞密度稀释3!
12、IJ1. OX 108个ImL2.5 X 108个/mL.6. 1. 1. 2 家畜血细胞的收集采集10mL20 mL家畜新鲜血攘，加入等体积红细胞裂解液，37C下放置1h.4 c下，583g离心5 min，其余步骤同6.1.1.1。6. 1. 1.3 畜禽其他组织细胞收集在干冰或液氮存在的条件下，将新鲜的畜禽组织碾成粉末，悬浮在PBS中，振荡混匀，用两层纱布过滤。其余步骤同6.L 1. 1. 6. 1. 2 细胞裂解取细胞密度为1.0X108个ImL2.5X108个ImL的悬液和1%低熔点琼脂糖在45c下放置5min 后，等体积1昆匀，隔3min气5min再混匀一次。将100L混合液置于专用
13、模具中，4c下放置15min 30 min形成凝胶块。将凝胶块置于含有0.1mg/mL蛋白酶K和30mL 1% NDS缓冲液中，50c下水浴3 h后更换相同缓冲液，再50c水浴24h28 h。用30mL TE缓冲液(pH7.6)在30min内洗涤3次(冰上操作)以去除TE缓冲液，置于1.0 mmol/L苯甲基磺歌氟Cphenylmethyl sulfonyl fluoride , PMSF)中，50 C下水浴30min，中间换液一次。将凝肢块储存于0.5mol/L EDTA (pH8. 0)中4C可保存半年。6. 1. 3 基因组DNA酶切与回收将凝胶块在4C下用30mL TE缓冲液浸泡3h4
14、 h，中间换液3次4次。置于1mL的适宜限制性内切酶缓冲液中，冰浴1h，中间换液1次。分别移至不同酶量(1U20 U)的酶切缓冲液中，冰上渗透1h后，37c下酶切10min30 min，用1/10体积0.5mol/L EDTA(pH8. 0)终止反应。将不完全消化的DNA凝胶块在0.5XTBE中，13C ,180 V120 V，120。角，脉冲时间60s10 s条件下进行PFGE电泳，电泳时间16h24 h. 6.1.4 最适DNA片段获得6. 1. 4. 1 第一次电泳选择用1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切获得的大分子量DNA，电泳条件同6.1.3，电泳时间24h.电泳结GB/T 25170-20
15、10 束后，取出凝胶，将DNA分子量标尺与相邻胶切下，在0.5XTBE中染色40min后。置于长波紫外灯下观察，用标尺测量并标记凝胶块所需回收的分子量的片段(100kb400 kb)。6. 1. 4. 2 第二次电泳选择将未染色的样品条带切成100kb200 kb、200kb300 kb和300kb400 kb三段。用新的1%琼脂糖凝胶进行第二次脉冲电泳，电泳条件同第一次电泳选择条件。根据DNA分子量标尺切下各条带中100kb400 kb的DNA片段，用TE洗2次3次，保存在O.5 mol/L EDT A中。6. 1. 5 电洗脱6. 1. 5. 1 透析袋处理透析袋在2%(质量浓度)NaHC
16、03和1mmol/L EDTA(pH8. 0)溶液中煮沸10min，用蒸馆水彻底漂洗，再置于1mmol/L EDT A(pH8. 0)中煮沸10min后冷却，40C下保存于纯水中。6. 1. 5. 2 电泳将不同大小范围DNA胶条分别放入一透析袋中，用0.5XTBE充满透析袋，浸泡在0.5XTBE的电泳槽中，130C，120。角，4V/cm5 V/cm电泳3h，使DNA分子从凝胶中移出。将透析袋旋转1800，再电泳30sl min，以解析透析袋上的DNA分子。6. 1. 5.3 电泳后处理电泳结束后将透析袋在4oC下0.5XTE中透析12h，从透析袋中将回收的DNA溶液吸出，依照一定的分子量标
17、尺对回收的基因组DNA进行定量。保存于4oC，一周内使用。6.2 BAC质粒载体制备6.2.1 BAC载体制备SDS碱裂解法制备BAC载体。将含有适当BAC质粒的菌液涂布于含12.5g/mL的氯霉素的LB平板上，37oC培养12h。挑单个菌落接种到LB液体培养液中，200r/min, 37 oC振荡过夜。将6 mL培养物，40C下，20000g离心1min，收集细菌。细菌沉淀悬浮于碱裂解液I中，剧烈振荡。加新配制的碱裂解液E于细菌悬液中，颠倒混匀，放置于冰上。加碱裂解液皿，颠倒混匀。4oC下，20000g离心30min，取上清，加入O.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10mino 4 oC下，
18、20000g离心30min, 回收核酸沉淀。用70%的乙晖涮洗管底及管壁，室温干燥DNA沉淀。用TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。6.2.2 超螺旋质粒纯化密度梯度离心法纯化超螺旋质粒。每毫升DNA样品加1.00 g固体CsCl，至完全溶解。加DNA和CsCl溶液，棍匀，加石蜡油，800000g离心24h后，可见两条相隔约4mm的清晰条带，弃石蜡油和部分溶液，吸取线环式质粒和超螺旋质粒于一离心管中。收集液体于透析袋中，依次用2.0L O. 5XTE 透析3h ,4 L O. 5XTE透析4h , 4 L O. 5XTE透析12h。收集液体，40C保存。6.2.3 BAC载体酶切和去磷酸化用适当的
19、限制性内切酶进行酶切，反应体系为20L10X缓冲液;100L(5g10g)载体DNA;lL 40 mmol/L亚精胶;适当的限制性内切酶;用ddH20定容至150L，37oC下酶切6h后，加入2.0L1 U/L牛小肠碱性磷酸酶(calfintestinal alkaline phosphatase, CIAP )和20L10X CIAP缓冲液，用ddH20定容至190L，370C放置1h后，70oC反应15min，进行去磷酸化。通过低熔点琼脂糖凝肢电泳分离载体DNA，染色，紫外灯显示条带，经熔化凝胶和酣、三氯甲烧抽提进行载体DNA的回收。6.2.4 载体脱磷效果检测分别用T4DNA连接酶和T4
20、DNA连接酶缓冲液及T4多核昔酸激酶对所制备的载体于16oC自连12h。取1.5L2.0L连接产物加到18L20L适当的感受态细胞中，370C下，在SOC培养基中，200r/min下培养1ho将转化的菌液适量涂布于含有氯霉素、IPTG和X-gal的LB固体培养基表面，于37oC下放置24h36 h，检测脱磷效率。GB/T 25170-2010 6.2.5 载体连接率检测16 c下，将制备的载体与经酶切的DNA在T4DNA连接酶的作用下连接12h。反应体系为1.0L T4 DNA连接酶;10L2倍连接酶缓冲破;10L(约25ng)载体DNA;2.5L(约100ng) 100 kb标准外游、片段。
21、把灭活后的连接产物加到适当的感受态细胞中，经培养后取适量菌液涂布于含氯霉素、IPTG和X-gal的LB固体培养基表面，37C下，培养24h36 h，随机挑取若干个白色商落于3 rnL LB液体培养基中培养12h。提取少量质粒DNA，经酶切后进行脉冲电泳检测，电泳条件同酶切回收，电泳时间24h。脉冲结束后，经染色，检测外源片段插入情况。6.3 感受态细胞制备取-80C冰箱中保存的适当的菌种复苏，培养至光密度值(opticaldensity , OD600)约为O.72 O. 76后，置于冰水氓合物中骤冷，4C下1OOOg离心10rnin，弃上清。用ddH20重悬菌体，4C下1000g离心10rn
22、in，弃上清。加10%甘油重悬，4c 1 OOOg离心10rnin，重复2次，弃上清，用残存管底的甘油悬浮细胞，4c下1000g离心2rnin，弃上清，用1.0 rnL 10%甘油重悬细胞以每管100L分装于离心管中，-80C保存。6.4 基因组DNA和载体DNA的连接将回收的大片段DNA与30ng制备好的载体以1: 21 : 3的比率连接，连接体系含400U的T4DNA连接酶，16C下连接12h , 65 C温育15rnin，将连接产物转移到O.025m的透析膜中央，用O. 5XTE 4 c透析2h。从透析膜上回收透析产物，再用0.5X TE+30%的PEG8 000 4 C透析30 rni
23、n，浓缩连接混合物中的DNA。6.5 电转化将造当的感受态细胞置于冰上解冻后，取20L感受态细胞，加入2.0L重组体连接物，冰上放置1 rnin5 rnin。将混合液加入预冷的电击杯中，电击。取出电转化后的细胞移至1rnL 37 C的SOC培养基中，混匀，37c下225r/rnin培养1h1.5h。铺于含有氯霉素、IPTG和X-gal的固体LB培养基表面，37C倒置培养24h。随机挑选自斑，用酶切鉴定插入大小，片段大小应在100kb以上，转化次数在50次左右，可以进行大量连接和转化。转化后的菌液用含10%甘油的LB冻存液，以每份500L分装，于一80C保存。7 基因组BAC文库的保存取出转化的
24、冻存菌液，于冰上融化。取适量菌液涂于氯霉素板上，37C培养24h。将LB培养冻存液以每孔110L，加到384孔培养板中。将氯霉素平板上的白色菌落挑至384孔板，每孔1个菌落。将384孔板置于专用摇床中，37C下培养24h，取出384孔板进行编号，即为文库母板。将文库母板置于一80C冰箱中长期保存。8 文库的扩增及应用应用自动平板复制器将己构建好的文库母本复制若干份，复制完成后将384孔板置于专用摇床中，37 C下培养24h，一80c保存工作文库，进行后续相关研究。5 OFON|ch户的NH阁。华人民共和国家标准畜禽基因组BAC文库构建与保存技术规程GB!T 25170-2010 国中祷中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数11千字2010年11月第一次印刷开本880X12301/16 2010年11月第一版* 定价16.元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-40632 G8/T 25170-2010 打印日期:2010年12月3日F002
