1、ICS 67050C 53 a雪中华人民共和国国家标准GBT 2 1 329-2007动物源性食品中庆大霉素残留量测定方法酶联免疫法Method for the determination of gentamicin residues in animaloriginal food-Enzyme-linked immunosorbent assay2007-10-31发布 2008040 1实施宰瞀髁紫瓣警糌赞鐾发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 昂本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起
2、草人：施伟良、张晓峰、方莹、谢文、朱振江。本标准系首次发布的国家标准。GBT 21329-2007动物源性食品中庆大霉素残留量测定方法酶联免疫法GBT 21329-20071范围本标准规定了肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中庆大霉素残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中庆大霉素残留量的测定。本标准的方法检出下限：肉类和水产品为100tgkg；内脏、牛奶和奶粉中为200 b-gkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的
3、各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6379(所有部分)测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 1992，neqSO 3696：1987)3原理微孔板中包被有绵羊抗兔IgG抗体，加入特异性抗体(兔抗庆大霉素抗体)、酶标记庆大霉素、庆大霉素标准品或样品后，特异性抗体与包被的绵羊抗兔IgG抗体结合，同时游离庆大霉素和酶标记庆大霉素竞争性的与特异性抗体结合。通过洗涤除去未结合的庆大霉索和酶标记庆大霉素，然后加入底物显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中庆大霉素的含量。
4、4试剂和材料除去另外说明外，所有试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41 庆大霉素检测试剂盒(组成参见附录A)。42三氯乙酸。43氯化钠。44氯化钾。45磷酸二氢钾。46磷酸氢二钠。47磷酸二氢钠。48吐温一80。4。9 3三氯乙酸：称取3 g三氯乙酸(42)，用水定容至100 mL。410 PBS缓冲液：85 g氯化钠，115 g磷酸氢二钠，027 g磷酸二氢钠，用水定容至1 L。411 SDB缓冲液：115 g磷酸氢二钠，02 g磷酸二氢钾，02 g氯化钾，30 g氯化钠，05 mL吐温一80，用水定容至1 L。412正已烷。413庆大霉素标准品为USP级。414庆大霉索标准
5、品溶液的配制：用灭菌水作为溶剂配制成50 mgmL的储存液，于一20(3条件下保存。16BT 2132920075仪器51酶标仪。52 八道移液器：50 pL300 pL。53单道移液器：5弘L50 btL，100 pL1 000 PL和2 mL10 mL。54混合振荡器。55离心机。56具塞试管：20 mL，50 mL。6试样的制备与保存61试样的制备对组织样品：从全部样品中取有代表性样品，混匀，用四分法缩分出不小于1 000 g试样，去除脂肪、充分绞碎、混均、分装、密封，并加以标识。对牛奶和奶粉；从原始包装中取有代表性样品，充分混匀，用四分法缩分出不小于500 g试样，装入清洁密闭容器，加
6、封后标明标记。62试样的保存将样品于一18C-20条件下保存。7分析步骤71提取711组织称取25 g去脂肪均质样品，精确到01 g，置于50 mL具塞试管中，加入5 mLPBS缓冲液(410)振荡10 min，加入10 mL的3三氯乙酸(49)涡旋10 min，6 000 rmin离心15 rain。取3 mL上清液于一干净试管，再N-&2 mL正己烷(412)混合；3 000 rmin离心10 min，吸取150 pL下层液体加350“L的SDB(411)缓冲液，调节pH至75左右。最后稀释倍数为20。712牛奶牛奶样品先离心去脂肪，然后以SDB缓冲液(411)直接做10倍稀释；对于奶粉则
7、可以先用与样品质量相等的水进行稀释溶解，离心去脂，然后再以SDB缓冲液(411)做5倍稀释，调节pH至75左右，最后稀释倍数为10。72测定条件721酶标仪测定条件酶标仪测定波长为450 nm。722洗板条件7221人工洗涤次数5次以上，每次注水量为250 pL。7222自动洗板可以预定5次周期。723操作条件所有操作应在室温下(2024)进行，庆大霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温(2024)后方可使用。73测定步骤”731将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准品及样品等在微孔架上的位置。1)给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操
8、作步骤有不同，需经实验评估后采用。GBT 213292007732吸取100 pL零浓度标准品于孔A1、A2；并吸取50 pL零浓度标准品于孔B1、B2；分别吸取50 pL庆大霉素标准溶液(o25、05、10、20、100、500 ngmL)于C1、C2 H1、H2；吸取50“L样品溶液于其余微孔中。733分别吸取25L庆大霉素酶标记物溶液于除A1、A2外的每一个微孔。734分别吸取25”L庆大霉素抗体溶液于除A1、A2外的每一个微孔。735用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀。736将酶标板置于4避光孵育1 h。737倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中
9、过多的残液，但不能使微孔干燥。再立即用洗涤缓冲液按722条件进行洗板，要注意不能使微孔干燥。738迅速加入100 pL底物溶液于每一个微孔底部，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于2024避光孵育30 min。739迅速加入100 pL反应终止液于每一个微孔。持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔架置于酶标仪中，在450 nm处测量吸光度(加入反应终止液后应在30 rain内读取吸光度)。注：测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。74平行试验按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。75空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。76监控试验每次测定均应做一个
10、添加庆大霉素标准(414)的样品。8结果计算从含有标准品和样品的板孔的吸光度(OD)值中，减去空白孔A1、A2的平均OD值。标准品和样品的OD平均值除以零标准(B1、B2)的平均OD值，再乘以100。零标准为100(最大吸光度值)，其他OD值为最大吸光度值的百分数。在半对数坐标纸上，以吸光度值为纵坐标(oA)，庆大霉素标准溶液浓度(,ugL)为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的庆大霉素浓度后，结果按式(1)进行计算：x一筹等等 m1 UUU式中：x样品中庆大霉素的残留量，单位为微克每千克(,ugkg)；c从标准工作曲线上得到的样品中庆大霉素浓度，单位为纳克每毫升(ngm
11、L)y样品溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克(g)。注：所得结果应表示至一位小数。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。9确证试验如被测样品中庆大霉素残留量的值大于限量要求时，应用其他方法进行确证。回收率参见附录B。GBT 2 1 3292007附录A(资料性附录)庆大霉素试剂盒”A1预包被抗体的96孔板：12条8孔。A2庆大霉素标准溶液：0、025、05、10、20、100、500 ngmL。A3庆大霉素酶标记物冻干粉：根据庆大霉素试剂盒中说明，可用稀释缓冲液配制成庆大霉素酶标记物溶液。A4抗庆大霉素抗体冻干粉：根据庆大霉素试剂盒中说明，可用
12、稀释缓冲液配制成抗庆大霉素抗体溶液。A5底物TMB溶液。A6稀释缓冲液：根据庆大霉素试剂盒中说明，可用水配制成洗涤缓冲液。A7洗涤浓缩液(10倍浓缩)：可用水稀释后使用。A8反应终止液。注：试剂盒应在48避光条件下保存，溶解后的酶标记物和抗体溶液需在一15(2条件下冻存。2)给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。附录B(资料性附录)回收率本方法中庆大霉素添加浓度及回收率的试验数据：a)组织样品(包括水产品)：添加量为lO ttgkg时，平均回收率为839973；添加量为50tLgkg时，平均回收率为868948；添加量为500 ttgkg时，平均回收率为88o965；b)肝、肾样品：添加量为20$,gkg时，平均回收率为902994；添加量为200 ttgkg时，平均回收率为930974；添加量为1 000$-gkg时，平均回收率为930974c)牛奶样品：添加量为20 tLgkg时，平均回收率为956；添加量为200 tLgkg时，平均回收率为882；添加量为1 000-gkg时，平均回收率为937。GBT 2 1 329-2007
