1、ICS 67120B 45中华人民 ，-H、-禾口，、I n 国国家标准农业部1163号公告一72009动物性食品中庆大霉素残留检测高效液相色谱法埘gh performance liquid chromatographic method fordetermination of Gentamycin residues in animal food2009-0206发布 20090301实施中华人民共和国农业部发布刖 昌农业部1 163号公告一72009本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：华中农业大学。本标准主要起草人：袁宗辉、陶燕飞、陈冬梅、王玉莲
2、、黄玲利、彭大鹏、戴梦红、刘振利。1范围农业部1 163号公告一72009动物性食品中庆大霉素残留检测高效液相色谱法本标准规定了动物可食性组织和牛奶中庆大霉素残留的高效液相色谱测定方法。本标准适用于猪的肾脏、肌肉，牛的肾脏和肌肉，鸡的肌肉，以及牛奶中庆大霉素残留量的测定。2规范性Bl甩文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682 1992分析实验室用水规则和试验方法。
3、3制样31样品的制备牛奶(新鲜或冷藏)；取新鲜或冷冻空白、供试组织，去除筋膜，绞碎使均匀。32样品的保存牛奶冷藏；组织一20以下贮存。4测定方法4 1方法提要或原理试料用水、100三氯乙酸溶液、磷酸缓冲液、10三氯乙酸溶液提取，C；s SPE柱净化，甲醇洗脱。高效液相色谱柱后衍生，荧光检测，外标法定量。42试剂和材料以下所用试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GBT 6682规定的一级水。4 21 庆大霉素硫酸盐对照品，含量高于99o。4 2 2甲醇：色谱纯。4 2 3正己烷。424磷酸二氢钾：优级纯。4 2 5硼酸：优级纯。42 6硼酸钠：优级纯。4 2 7氢氧化钠：优级纯。4 2 8
4、氢氧化钾：优级纯。4 2 9氯化钾：优级纯。42 10氯化钠：优级纯。4 2”三氯乙酸：优级纯。4 2 12邻苯二甲醛：色谱纯。】农业部1 163号公告一720094213磷酸氢二钠：优级纯。4 2 14正己烷磺酸钠：色谱纯。4215 2巯基乙醇：优级纯。4216磷酸二氢钠：优级纯。4 2 17流动相A称取无水磷酸-钾1300 g，硼酸600 g，加水溶解并稀释至1 000 mL。4 218流动相B称取氢氧化钾560 g，加水溶解并稀释至1 000 mL。4219流动相c称取氯化钾7500 g，加水溶解并稀释至1 000 mL。4220磷酸盐缓冲液称取氯化钠850 g，磷酸氢二钠358 g，磷
5、酸二氢钠312 g，加水溶解并稀释至1 000 mL。4 221 100三氯乙酸溶液(wy)称取三氯乙酸100 g，加水溶解并稀释至100 mL。4222 10三氯乙酸溶液(WV】称取三氯乙酸1000 g，加水溶解并稀释至100 mI。4223正己烷磺酸钠溶液称取正己烷磺酸钠094 g，加水溶解并稀释至250 mI。4 2 24正己烷磺酸钠缓冲液称取正己烷磺酸钠094 g，加水溶解，加乙酸05 mL，用水稀释至250 mL。4225衍生化试剂称取硼酸钠400 g，氢氧化钠100 g，用水800mL溶解；称取邻苯二甲醛100mg，用甲醇10mL溶解，将邻苯二甲醛甲醇溶液加入硼酸钠缓冲溶液中，用水
6、稀释至1 000 mL，加2巯基乙醇2 n1L，混匀，现配现用。4 226标准贮备液称取庆大霉素标准品适量，用水分别溶解并稀释制得含庆大霉素为1 ragmL的标准贮备液，28避光保存，有效期6个月。4 2 27标准工作液取适量庆大霉素标准贮备液，用磷酸盐缓冲液稀释定容，得到庆大霉素浓度为100 pgL、200弘gL、500肛gL、1 000pgI、2 000tgL、5 000tlg。、10 000pgL、50 000pgI。的标准工作液，2。C8避光保存，有效期l周。43仪器和设备431高效液相色谱仪：配荧光检测器和柱后衍生系统。43 2分析天平：感量0000 01 g，0000 1 g，00
7、01 g。433离心机(5 000 rrain)。43 4冷冻高速离心机(10 000 rrain)。43 5电热恒温水浴锅。4 3 6旋涡混合器。4 3 7组织匀浆机。4 3 8 C18固相萃取柱(100mg3mL)。2农业部1 163号公告一720094 4测定步骤4 4 1试料的制备试料的制备包括：取均质后的供试样品，作为供试试料；取均质后的空白样品，作为空白试料。442提取取猪肾脏、肌肉，牛肾脏、肌肉，鸡肌肉试料(5o05)g置于聚丙烯离心管中，加水10mL，混匀，静置30 rain，加100三氯乙酸溶液05 mL，混匀，静置10 min，4 200 rrain离心10 rain，转移
8、上清液至聚丙烯离心管中，加正己烷5 mL，混匀，静置10 rain，弃正己烷层，加正己烷磺酸钠溶液2 mL，混匀，供SPE净化。量取牛奶试料(5士o05)mI，置于聚丙烯离心管中，加磷酸缓冲液5 mL，混匀，静置30 min，加lo三氯乙酸溶液5mL，混匀，静置10min，4 200 rmin离心10rain，转移上清液至聚丙烯离心管中，加正己烷5mI。，混匀，静置10min，弃正己烷层，加正己烷磺酸钠溶液2mL，混匀，为备用液，供SPE净化。4 4 3净化固相萃取柱依次用甲醇、水、正己烷磺酸钠缓冲液各3 mL活化，取备用液上柱，依次用水、KP,烷磺酸钠缓冲液各1mL淋洗，甲醇2mL洗脱，收集
9、洗脱液，40。C水浴氮气吹干，用水10mL溶解，并转入15mL聚丙烯离心管，10 000 rmin离心10min，取上清液供高效液相色谱检测。44 4标准曲线的绘制取42，27标准工作液，注入高效液相色谱仪检测，将测得的峰面积与相对应浓度绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。445测定445 1液相色谱条件a)色谱柱：ALKIONTM(Catlonexchange)4 mmX 150 mm离子交换柱；b)流动相梯度洗脱程序见表l：表1梯度洗脱程序Time，min A， B， C，0 70 30 013 70 30 013 1 48 48 418 48 48 4c)检测器波长：Ej：235 Dm，
10、E二：465 11111；d)进样量：50 uL；e)柱温：30；f)反应器温度：45；g)柱后流速：03 mLrain。4 4 5 2液相色谱测定取443上清液和相应的标准溶液，做单点或多点校准，按外标法，以峰面积定量。色谱图参见附录A。446空白实验除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。4 5结果计算与表述试料中庆大霉素的残留量(弘gkg或pgL)按式(1)计算：3农业部1 163号公告一7-_2009 x一错式中：X试料中庆大霉素残留量，单位为微克每升(”gL)；A试样溶液中庆大霉素衍生物的峰面积；Ar一标准工作液中庆大霉素衍生物的峰面积；Cs标准工作液中庆大霉素的浓度，单位
11、为微克每升(“gL)；y溶解残余物所得试样溶液体积，单位为毫升(mL)；W样品质量或体积，单位为克或毫升(g或mL)。5检测方法灵敏度、准确度、精密度5。1灵敏度本方法测定庆大霉素的检测限为50 pgL；在肌肉、肾脏组织中庆大霉素的定量限为50“gkg；在牛奶中庆大霉素的定量限为50 ngL。52准确度本方法测定在猪肾脏、牛肾脏中庆大霉素添加浓度为50 pg始100 pgkg的回收率为70110，添加浓度为100嵋kg2 500肛gkg的回收率为80110，猪、牛、鸡肌肉中庆大霉素添加浓度为50pgkg200 pgkg的回收率为70110。在牛奶中，庆大霉素添加浓度为50弘L200gL的回收率
12、为70110。53精密度本方法的批间变异系数CV20。附录A(资料性附录色谱图农业部1 163号公告7-2009圈A1 庆大霉素标准溶液浓度为1 000鹏L色谱图图A 2猪肌肉样品空白色谱图5农业部1 163号公告-7-20096图A3猪肌肉添加庆大霉素浓度为50腭kg色谱图图A 4猪肌肉添加庆大霉素浓度为200陷l【g色谱图图A 5牛肌肉样品空白色谱图农业部1 163号公告一72009200 400 600 800 1000 L200 L4_00 1600图A6牛肌肉添加庆大霉素浓度为50 j,gkg色谱图图A 7牛肌肉添加庆大霉素浓度为200 lIgkg色谱图图A 8鸡肌肉样品空白色谱图农
13、业部1 163号公告一7-20098400 600 800 i& 1200 1400 1600图A 9鸡肌肉添加庆大霉素浓度为50暑kg色谱图图A 10鸡肌肉添加庆大霉素浓度为200峙kg色谱图图A 11牛奶样品空白色谱图农业部1 163号公告一72009200 4oo 600 800 lOOO 1200 1400 16,oo图A 12牛奶添加庆大霉素浓度为50 pgL色谱图4 00 6oo 8 co 1000 12oo 14 oo 16oo图A13牛奶添加庆大霉素浓度为200 agL色谱图400 8 00图A 14猪肾脏样品空白色谱图农业部1 163号公告-7-200910图A 15猪肾脏添加庆大霉素浓度为50Igkg色谱图2m 400 600 800 1000 1260 1400 1600图A 16猪肾脏添加庆大霉素浓度为2 500 IIglg色谱图图A 17牛肾脏样品空白色谱图200 4 00 600 800 1000 1200 i400 1600图A 18牛肾脏添加庆大霉素浓度为50 Igkg色谱图2 00 400 600 800 1000 1200 14 00 16图A 19牛肾脏添加庆大霉素浓度为2 500 IIgkg色谱图
