1、ICS 65.020.01 B 16 道B和国国家标准11: ./、中华人民GB/T 28100-2011 香石竹细菌性萎焉病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Burkholderia caryophylli CBurkholder) Yabuuchi et al. 2011-12-30发布2012-06-01实施的轨轨 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 28100-2011 目lJ1=1 本标准按照GB/T1. 12009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。
2、本标准起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:邵秀玲、王有福、赵文军、甘琴华、厉艳、王英超、尼秀媚、粟智平、吴兴海、张治宇、余冬冬。I GB/T 28100-2011 香石竹细菌性萎焉病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了香石竹细菌性萎焉病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于石竹属、满天星等植物种苗及产品中香石竹细菌性萎焉病菌的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T
3、4789. 28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程3 香石竹细菌性萎蔷病菌基本信息中文名:香石竹细菌性萎焉病菌。学名:Burkholderia caryohylli (Burkholder 1942) Yabuuchi et al. 1993 Pseudomonas caryo户hylli(Burkholder 1942)Starr &. Burkholder 1942 中文俗名:靡香石竹伯克霍尔德氏菌、石竹伯克霍尔德氏菌、红掌细菌性叶疫病病害英文名:bacterial wilt of carnation. 属原核生物界(Procaryotae
4、)薄璧细菌门(Gracilicutes)暗细菌纲(Scotophobia)假单胞菌目(Pseudomonadales)假单胞菌科(Pseudomonadaceae)伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)。通过感染病菌的切割部分进行短距离传播。香石竹细菌性萎焉病菌基他信息参见附录Ao4 方法原理经现场查验，实验室用显微镜、定量PCR仪等仪器设备对样品进行检测，根据病原菌的菌落特征、菌体形态、生理生化特性及致病性测定和分子生物学检测结果进行判定。5 仪器设备和用具5. 1 仪器设备电子天平(感量0.0001 g)、植物生长培养箱、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜
5、(具照相系统)、高速冷冻离心机(12000 r/min)、小型离心机、纯水仪、恒温水浴锅、低温冰箱、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、电动搅拌器、真空冷冻干燥机等。5.2 用具培养皿、试管、可调式微量进样器(2L、10L、20L、100L、200L、1000L)及其枪头、研钵、G/T 28100-2011 离心管(1.5 mL、1.0 mL)、PCR管(0.2L)、量筒、烧杯等。6 试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。培养、鉴定香石竹细菌性萎焉病菌所用培养基参见附录Bo7 检测鉴定7. 1 现场检瘟7. 1. 1 样晶数量按SN/T1157的规定执行。7. 1. 2 症状观
6、察该菌侵染植株后，可在导管周围产生大量堵塞导管的赘生物，随之导致维管束变色，茎基部节间开裂溃癌，切开病茎可见有棕黄色软泥状菌液溢出;感染病菌的植物叶片和茎呈灰绿色，叶片逐渐变黄枯萎;严重者根茎部腐烂，直至植株枯萎死亡。症状显示后，植株4般会在1个2个月内死亡，通过检查成熟植株地上部分呈现出灰绿色症状很容易进行判断。7.2 实验室检测鉴定注2实验室检测鉴定流程图参见附录C，7.2.1 样品初筛通过肉眼或显微镜观察，对危害症状不明显的潜在感染可直接通过分子生物学检测进行样品初筛，初筛阳性的样品需完成7.2. 27. 2. 6的检测。危害症状明显的样品需进行7.2. 27. 2. 7的检测，30oC
7、以上的培养条件可提高症状出现的速度。7.2.2 病原菌的分离与培养取可疑植物组织，75%酒精消毒，元菌水洗3次后，放在无菌的载玻片上用元菌的玻璃棒研碎，滴一滴元菌水于研碎的病组织上。静置2min5 min后，用稀释法或无菌的移植环蘸取以上组织液在培养基平板上划线，28.C培养24h48 h后，观察菌落生长情况。7.2.3 菌落特征病原菌在523培养基上呈圆形凸起，边缘整齐，透明，表面发亮，生长快，培养48h菌落直径2mm 左右(参见附录D);在NA培养基上生长缓慢;在Kings B培养基上，菌落黄色不透明，不产生荧光色素。如果发现可疑菌落，需进行2次3次菌种纯化。7.2.4 形态特征按GB/T
8、4789.28中规定的方法进行革兰氏与鞭毛染色，显微镜观察菌体形态。菌体杆状，少数呈丝状体，或稍弯曲的杆状，(0.35mO.95m)X(1.05m3.18m)，菌体排列方式多样，有链状条纹、并列排列或成堆状排列等多种排列方式，其有1至数根极生鞭毛，活动性好。GB/T 28100-2011 7.2.5 生理生化该菌好氧，元芽抱，可氧化分解单糖、双糖、多糖，并可利用唯一的碳源和氮源，为致病菌。按GB/T 4789.28规定的常规方法、生化管或BIOLOG微生物鉴定系统等辅助进行生理生化特性测定(见表1)。表1B. caryophylli鉴定常用的生理生化特征表生理生化特征香石竹细菌性萎斋病菌(B.
9、caryohylli) 革兰氏染色接触酶十氧化酶反硝化十硝酸盐还原十精氨酸双水解酶+ 葡萄糖氧化发酵+ 明胶水解淀粉水解甲基红试验v-p试验最适生长温度CC)28 注:十:90%以上菌株为阳性;一:90%以上菌株为阴性。7.2.6 致病性测定将纯化培养48h的菌株用元菌水配成106CFU/mL10日CFU/mL的菌悬液，用注射法接种于5叶龄6叶龄幼嫩的香石竹根茎部，元菌水作阴性对照，标准菌株作阳性对照，30.C 33 .C保湿培养48 h, 10 d14 d左右观察病菌侵染症状。如果产生典型的症状，表明所分离的菌株具有致病性，需要从接种植株上再次分离病菌，再分离的纯菌株应具有与原菌株一致的病原
10、特征，否则判定所分离的菌株不具有致病性。7.2.7 PCR法检测PCR检测实验方法见附录E。8 结果判定8. 1 无症状植物对元症状的植物体直接进行分子生物学检测进行初筛，如果检测结果为阴性，实验最终判定为阴性，如果检测结果为阳性，需完成7.2. 27. 2. 6的检测，进一步进行结果判定。8.2 有症状植物对有症状的植物体需进行病菌分离，如果所分离的菌株在培养基上的菌落特征、生理生化特性与标3 GB/T 28100-2011 准相符，且菌株致病性测定为阳性，可以初步判定待检菌株为香石竹细菌性萎焉病菌，需做分子生物学方法进行确认，如果PCR检测结果为阳性，可以最终判定为检出香石竹细菌性萎焉病菌
11、，否则结果判定为阴性。9 菌株保存从检测样品中分离到并鉴定为香石竹细菌性萎焉病菌的菌株，应妥善保存。将菌株转接到试管斜面上，28.C恒温培养48ho然后置于4.C冰箱中保存，定期(30d60 d)转接，防止病菌死亡;或在菌悬液中加入15%30%的甘油于一800C下保存;必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉，-80.C下长期保存。4 GB/T 28100-2011 附录A(资料性附录)香石竹细菌性萎焉病菌的相关资料A.1 地理分布中国(吉林、云南西双版纳、台湾)、印度、以色列、日本、奥地利、保加利亚、丹麦、法国、德国、匈牙利、爱尔兰、意大利、荷兰、奥地利、波兰、塞尔维亚、挪威、被兰、斯洛伐克、
12、瑞士、英国、南斯拉夫、加拿大、美国(佛罗里达州、伊利诺斯州、印地安那州、爱荷华州、马萨诸塞外l、明尼苏达州、密苏里州、蒙大拿州、宾夕法尼亚州、纽约、华盛顿、阿根廷3巴西、哥伦比亚、乌拉圭A.2 寄主范围该病菌自然侵染的寄主有=爵香石竹Dianthuscaryophyllus、美国石竹Dianthusbarbatus、中华(波状)补血草Limoniumsintum、满天星Gy户so户hilapaniculata等。A.3 病原菌形态特征生物学特性该茵通过伤口进入植物体，随后侵染根茎的维管束，温度高于20oc可加速细菌生长及植物体症状显示，低温条件下感病植物不显示症状。植物体在轻微感染、低温保存的
13、条件下，病菌可潜伏2年3年才呈现症状，土壤温度低于17oc时，菌体细胞的快速繁殖造成对茎部导管的压力加大，通常在植物基部节间出现开裂，接着发展为溃菇。这种开裂与某几个栽培变种的生理开裂很相似，但病源开裂可见到有棕黄色菌液溢出，溃癌处会出现由腐生真菌引起的畸形生长，茎部形成空洞;在20oc 25 oc条件下，多为枯萎症状，少见溃茄，剥落的茎粘稠、棕黄色、宽窄不定，导管组织有纵向条纹，交叉处有不规则的水浸状褐色斑点;尽管低于200C的情况下茎开裂的状况很普通，但高于30oC的条件下萎焉症状很明显。A.4 传播途径病菌可通过带菌水侵染植物切口，主要的传播途径是通过感染病菌的切割部分，该部分携带病菌菌
14、源主要来自尚无症状显示的带菌母体，在自然条件下病菌只能进行短距离传播且速度很慢。调查显示，当植物茎部开裂时，菌液会流出并可传播到另一植物体。5 GB/T 28100-2011 B.1 523培养基庶糖酵母膏MgS04 .7H20 蛋白陈K2HP04 琼脂10.0 g 4.0 g 0.3 g 8.0 g 2.0 g 16.0 g 附录B资料性附录)常用培养基配方调整pH至7.07.1，121 oC湿热灭菌15min20 min。B.2 NA营养琼脂牛肉浸音蛋白陈琼脂酵母膏NaCl 1. 0g 5.0 g 17.0 g 2.0 g 5.0 g 蒸馆水1 000.0 mL 调整pH至7.4，1210
15、C湿热灭菌15min20 mino B.3 金氏B培养基蛋白陈20 g MgS04 .7H20 1. 5 g 琼脂粉15 g K2HP04 1.5 g 甘油10 mL 蒸馆水1 000 mL 调整pH至7.2，1210C湿热灭菌15min20 min。6 阴性附录C(资料性附录)实验室检测鉴定流程图分子生物学检测(未进行分子检测的1lf!1t: 致病性测定干( 检出) 在培养基上培养不符阴性图C.1实验室检测鉴定流程图GB/T 28100-2011 7 G/T 28100-2011 附录D(资料性附录)菌落特征及接种症状图D.1 523培养基上培养3d后的菌落特征图D.2NA培养基上培养5d后
16、的菌落特征图D.3菌体扫描电镜图片8 建坠瞩图D.4菌体透射电镜图片 写GB/T 28100-2011 图D.5接种病菌后香石竹表现症状(引自CourtesyDr J. Nmeth. ) 9 GB/T 28100-2011 附录E(规范性附录香石竹细菌性萎蕾病菌的分子检测方法E.1 细菌DNA模板的制备元菌操作下，将纯化后的待测菌制成菌悬液，或取可疑植物组织，按照细菌基因组DNA提取试剂盒方法提取基因组DNA，测定DNA浓度，一20.C保存备用。E.2 引物与探针FP: 5-CGGCACAAATGCGAGAACT-3 RP: 5-GACCCT A T AACG AGAGCGTCTCTCT-3
17、探针:5-F AM-AACCTGT AGCGCAAGCGGCTCG-T AMRA-3 E. 3 PCR反应体系E. 3. 1 普通PCR体系为25L:2 X PCR MasterMix 12.5L，引物(10mol/L)各1L，模板(DNA或菌悬液)1L，去离子水9.5L。E. 3. 2 定量PCR体系为25L:2XPCRMasterMix 12. 5L，引物(10mol/L)各1L，探针(10mol/L)1L，模板1L，去离子水8.5L.E.4 PCR反应条件94 .C , 5 min;40个循环;94.C ,15 s;62 .C ,l min;72 .C , l min;最后72.C延伸2
18、mino E. 5 PCR结果判定2%琼脂糖凝胶电泳检测普通PCR产物，如能观察到68bp左右的PCR产物条带，则可判定为可疑香石竹细菌性萎焉病菌，需进一步确认，否则判定为阴性。定量PCR反应Ct值小于35，结果判定为阳性，否则判定为阴性。10 FFON|OOFNH阁。华人民共和国家标准香石竹细菌性萎蕾病菌检疫鉴定方法GB/T 28100-2011 国中导中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销司除开本880X 1230 1/16 印张1字数20千字2012年4月第一版2012年4月第一次印刷晤节目:155066. 1-44654定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107G8/T 28100-2011 打印门期:2012年4月26HF002A
