1、 ICS 71.040 G 04 备案号： 14770-2004 浙江省地方标准DB33DB33/T 4552003动物毛发中盐酸克伦特罗残留的检测方法The analysis of clenbuterol hydrochloride in animal hair 2003-10-23 发布 2003-11-08 实施浙江省质量技术监督局发布DB33/T 4552003 I 前 言 本标准由嘉兴市卫生监督所提出并归口。 本标准由嘉兴市卫生监督所、浙江省疾病预防控制中心、浙江省畜产品质量安全检测中心、嘉兴市疾病预防控制中心负责起草。 本标准主要起草人：吴小龙、吴平谷、宣士荣、葛志坚、邹忠明、 汪
2、刚、王明龙、吴新民。 DB33/T 4552003 1 动物毛发中盐酸克伦特罗残留的检测方法 1 范围 本标准规定了以酶联免疫吸附（ ELISA）法和气相色谱 -质谱联用（ GC/MS）法测定动物毛发中盐酸克伦特罗的方法，规定气相色谱 -质谱联用法为仲裁法。 本方法适用于动物毛发中盐酸克伦特罗残留量的测定与仲裁。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 DB33
3、/T 307-2001 可食性动物组织中盐酸克伦特罗残留量的检测方法 DB33/T 308-2001 饲料中盐酸克伦特罗含量的检测方法 DB33/T 309-2001 动物尿液中盐酸克伦特罗残留量的检测方法 3 酶联免疫吸附法 3.1 原理 利用固相酶联免疫吸附原理，将盐酸克伦特罗特异性抗体 (羊抗兔 IgG )包被于聚苯乙烯微量反应板中，加入毛发提取液、盐酸克伦特罗标准品、酶标记物、盐酸克伦特罗抗体于微孔中，使毛发提取液（未知抗原）和酶标记物中的盐酸克伦特罗抗原（已知抗原）与抗体进行免疫竞争反应，未反应的酶记标物在洗涤中被清除，结合了的酶可以由显色物显示出来。用目测法或酶标法来判断。显色的强
4、弱与样品中的盐酸克伦特罗浓度成反比。 3.2 试剂和材料 以下所用的试剂和水，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为重蒸水。 3.2.1 盐酸克伦特罗固相酶联免疫试剂盒（德国 r-Biopharm 公司或类似产品）。 3.2.1.1 预包被微孔条。 3.2.1.2 标准品 （6 瓶300L/瓶， 浓度分别为 0ppt、 100ppt、 300ppt、 900ppt、 2700ppt、 8100ppt ） 。 3.2.1.3 盐酸克伦特罗酶标记物。 3.2.1.4 盐酸克伦特罗抗体。 3.2.1.5 基质液。 3.2.1.6 终止液。 3.2.1.7 缓冲液。 3.2.2 1%吐温-80、体积分数为
5、 3%乙醇/乙酸乙酯、体积分数为 5%乙醇/乙酸乙酯、乙酸乙酯、50%盐酸、1mol/L 氢氧化钠、饱和氯化钠、体积分数为 50%乙醇/乙酸乙酯。 3.2.3 盐酸克伦特罗 SLH 净化柱（1000mg/5mL，SLH 小柱为商品名，给出这一信息是为了给本行业标准的使用者提供方便，而不是标准主管部门对这一产品的认可）或同等效果的净化柱。 3.3 设备与器材 3.3.1 酶标仪。 3.3.2 洗板机。 3.3.3 离心机（3000 r/min - 4000r/min）。 DB33/T 4552003 2 3.3.4 超声清洗仪。 3.3.5 振荡器。 3.3.6 水浴锅。 3.3.7 旋转蒸发仪
6、。 3.4 样品处理 3.4.1 清洗：取毛发加 1%吐温-80 溶液在超声清洗仪中洗涤 20min，然后用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干；将毛发在 50干燥 2h，放在干燥器中待测。 3.4.2 水解：将毛发剪碎混合均匀，准确称取 0.1，加入mol/L氢氧化钠溶液mL，在80水浴中保温h 后冷却。 3.4.3 萃取：在水解液中加mL 饱和氯化钠溶液，用 50盐酸调节至 10 左右，加mL乙酸乙酯振荡，离心分出乙酸乙酯相，乙酸乙酯相用氮气吹干。 3.4.4 净化：加 2L 体积分数为 3%乙醇/乙酸乙酯溶液溶解剩余物，移到预先用体积分数为 3乙醇/乙酸乙酯溶液淋洗的盐酸克伦特罗 SLH 净化柱上
7、， 然后用mL体积分数为 5%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脱除杂，最后用 10mL 体积分数为 50%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脱，收集该洗脱液，用氮气吹干。用水 4mL 溶解剩余物，待测。 3.5 测定（或参考类似产品说明书） 将试剂盒各组分取出，平衡至室温(20-25)。 3.5.1 以 1：11 的比例吸取盐酸克伦特罗抗体加入到缓冲液中，待用。 3.5.2 以 1：11 的比例吸取盐酸克伦特罗酶标记物加入到缓冲液中，待用。 3.5.3 每孔加入已稀释盐酸克伦特罗抗体 100L，15min 后洗板。 3.5.4 分别加入标准品、待测样品(标准品和样品做两孔平行试验)各 20L。 3.5.5 每孔加入已稀
8、释盐酸克伦特罗酶标记物 100L，30min 后洗板。 3.5.6 加入 100L基质液避光显色 15min，加入终止液 100L。 3.5.7 酶标仪 450nm 测定。 3.6 结果计算 3.6.1 计算每个标准品和样品平均吸光度值。 3.6.2 每个标准品和样品平均吸光度值除以 0ppt 的吸光度值再乘以 100。以标准品的百分比形式的吸光度值为纵座标，以标准品的浓度为横座标，绘成一个半对数座标系统曲线图，相对应每一个样品的相对浓度（g/Kg）可以以样品平均吸光度值从曲线上查出，乘以样品稀释倍数，即为其实际浓度。 3.7 检测限 本方法的检测限: 8.0g/Kg 。 4 气相色谱-质谱联
9、用法（仲裁法） 4.1 原理 毛发样品经过碱水解，然后用乙酸乙酯提取； 提取液浓缩后经SLH柱净化，净化洗脱液经过双三甲基甲硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）+1%（ ）三甲基氯硅烷（TMCS）衍生，然后用GC/MS法测定。 4.2 试剂和材料 以下所用的试剂和水，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为重蒸水。 4.2.1 盐酸克伦特罗标准品。 4.2.2 1%吐温-80、体积分数为 3%乙醇/乙酸乙酯、体积分数为 5%乙醇/乙酸乙酯、50%盐酸、1mol/L氢氧化钠、饱和氯化钠、体积分数为 50%乙醇/乙酸乙酯、乙醇、甲醇、甲苯、乙酸乙酯、盐酸、氢氧化钠、浓氨水、无水硫酸钠。 4.2.3 BSTFA+
10、1%（）TMCS。 4.2.4 SLH 净化柱（1000mg/5mL）或同等效果的净化柱。 DB33/T 4552003 3 4.2.5 美托洛尔（metoprolol）内标：使用时用甲醇配成 10g/mL溶液。 4.2.6 4% （）氨化甲醇：取 4mL 浓氨水，用甲醇定容至 100mL。 4.2.7 克伦特罗标准储备溶液（100mg/L）：称取 11.3mg 盐酸克伦特罗标准品于 100mL 容量瓶中，用4%氨化甲醇溶解并定容至刻度，存放于 4冰箱中备用。 4.3 设备与器材 4.3.1 气相色谱-质谱联用仪。 4.3.2 旋转蒸发仪。 4.3.3 超声清洗仪。 4.4 实验条件 4.4.
11、1 色谱条件 色谱柱：HP 5MS5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m0.2 5 mm0.25m)； 进样口温度300，柱温程序：初温120，保持3min，然后以10min升至230，保持10min，再以20min升至270保持10min。 载气为高纯氦气（99.999%），流速0.9mL/min，不分流进样。 4.4.2 质谱条件 EI源，源温230；电子能量70eV；接口温度280； 电子倍增器电压1388V；质量扫描范围35 U350U； 选择离子监测方式（SIM）；盐酸克伦特罗监测离子（ m/z ）：86、243、262、333美托洛尔监测离子（ m/z ）：72。 溶剂延迟：
12、5min。 4.5 样品处理 4.5.1 取毛发加 1%吐温-80 溶液在超声清洗仪中洗涤 20min，然后用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干；将毛发在50干燥2小时， 放在干燥器中待测。 将毛发剪碎混合均匀， 准确称取0.2 g -1.0g， 加入 1mol/L氢氧化钠溶液 2mL，在80水浴中保温 1h 后冷却。在水解液中加 1mL 饱和氯化钠溶液，用 50%盐酸调节 PH 至 10左右，然后加 5mL 乙酸乙酯振荡，离心分出乙酸乙酯相，乙酸乙酯相过无水硫酸钠，用氮气吹干。加 2mL 体积分数为 3%乙醇/乙酸乙酯溶液溶解剩余物，移到预先用体积分数为 3%乙醇/乙酸乙酯溶液淋洗的 SLH 净化柱
13、上，然后用 5mL 体积分数为 5% 乙醇/乙酸乙酯溶液洗脱除杂，最后用 10mL体积分数为 50%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脱，收集该洗脱液，加美托洛尔内标 20L，用氮气吹干。 4.5.2 蒸发剩余物加 0.1 mL BSTFA+1%（）TMCS，加盖于旋涡混合器上震荡，在 80烘箱中加热 1h，然后用氮气吹干，加 0.1mL 甲苯溶解。同时取 20L0.5g/mL 克伦特罗标准工作液，加美托洛尔内标20L，吹干后同时进行衍生化。取 1.0L 甲苯溶液进行 GC/MS 分析。 4.6 测定 定性采用保留时间、标准盐酸克伦特罗棒图对照进行 NIST98 图库检索。以 86 作为定量离子， 262、333、 243 作为辅助离子进行定性、定量分析。 4.7 结果计算 定量方法：采用单点或多点校准法定量 ； 盐酸克伦特罗（以克伦特罗计）X=mL D/m 式中：X 样品中盐酸克伦特罗含量ng/g或ng/mL； mL质谱测定对应的盐酸克伦特罗含量 ng/g 或 ng/mL ； m 取样量g或mL ； D 稀释倍数 。 4.8 检测限 本方法的检测限: 8.0g/Kg。 _
