1、ICS 65.020 B 01 DB41 河南省地方标准 DB41/T 13792017 小麦品种冬春季抗寒性鉴定与评价 2017 - 04 - 24发布 2017 - 07 - 24实施 河南省质量技术监督局 发布DB41/T 13792017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河南省农业科学院提出。 本标准起草单位：河南省农业科学院小麦研究所 。 本标准主要起草人： 许为钢 、方宇辉 、齐学礼、王会伟 、李艳、李春鑫、董海滨。 本标准参加起草人：张煜、张文超、 赵明忠 、李正玲、郭瑞。 DB41/T 13792017 1 小麦品种冬春季抗寒性鉴定与
2、评价 1 范围 本标准规定了冬小麦品种冬春季抗寒性鉴定的术语和定义、鉴定方法 及评价。 本标准适用于小麦种质资源和品种的抗寒性鉴定 与评价。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4404.1-2008 粮食作物种子 第 1部分：禾谷类 NY/T 496-2010 肥料合理使用准则 通则 NY 525-2012 有机肥 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 冬季冻害 小麦在越冬期经历 0 以下连续低温或剧烈降温天气而导致的小麦生长停滞
3、、叶片枯死或死苗的现象。 3.2 春季寒害 又称倒春寒 ，春季 气 温回暖 后温度骤降到 0 （冰点温度）以上低温对小麦造成的伤害。 3.3 隶属函数 若对 论域 （研究的范围） U中的任一元素 x，都有一个数 A(x)0， 1与之对应，则称 A为U 上的模糊集， A(x)称为 x对 A的隶属度。当 x在U 中变动时， A(x)就是一个函数，称为 A的隶属函数。 4 抗寒性鉴定 4.1 鉴定前准备 4.1.1 种子选择 待测试 小麦种质资源和品种 的种子质量 应符合 GB 4404.1-2008的规定 。 4.1.2 播种 4.1.2.1 大田 DB41/T 13792017 2 播期为当地小
4、麦适播期。田间种植方法为随机区组排列， 3次重复，小区面积约 13.33 m2， 6行区，行距 20 cm左右，播量确保基本苗每 667 m24.1.2.2 盆栽 为 1214 万。施肥按大田常规管理，有机肥应符合NY 525 -2012的规定，化肥应符合 NY/T 496-2010的规定 。 选择直径 30 cm，高 35 cm的圆柱形盆 ，装肥沃表土并施足基肥，埋于试验田中，盆内土壤与盆外大田齐平。每个参试材料种植 4盆，每盆点播 20穴， 每穴 1粒，定苗 10株，施肥 管理参 见 4.1.2.1。 4.1.3 人工气候室设置 温度变幅为 0.5 ，白天 （8:00 20:00）采用人工
5、光源补光，光照强度为 600 mol m-2s-1冬季冻害鉴定，温度 为白天 -10 ，夜间 -13 。春季寒害鉴定，温度为白天 0 ，夜间 -3 。 。 4.1.4 取样 4.1.4.1 基本要求 当气温达到鉴定要求时，取小麦上部 3片新鲜展开 叶片 。 4.1.4.2 冬季冻害 自然条件下， 当气温降至最低温度（低于 -10 ）后，4 h8 h内取样。 盆栽条件下，小麦进入六叶一心时，将其移入人工气候室进行低温处理，以不进行低温处理的材料作为对照。植株经低温处理 12 h后进行取样。 4.1.4.3 春季寒害 自然条件下，气温发生比正常温度陡降8以上， 4 h8 h 内取样。 盆栽条件下，
6、 进入拔节期 后对小麦进行穗分化观察，发育至药隔期将其移入人工气候室 进行低温处理,对照设置和取样方法参见4.1.4.2 。 4.1.5 仪器与试剂 测定指标所需仪器 和试剂见附录 A中A.1.2 和A.1.3、附录 B中B.1.2和 B.1.3及附录 C中C.1.2 和C.1.3 。 4.2 鉴定方法 4.2.1 抗寒性指标测定 4.2.1.1 可溶性糖含量 采用蒽酮比色法。实验步骤和结果计算 见附录 A中A.2和A.3 。 4.2.1.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性 采用氮蓝四唑 (NBT)光化还原法。实验步骤和结果计算 见附录 B中B.2 和B.3。 4.2.1.3 丙二醛（MDA）含
7、量 采用硫代巴比妥酸（ TBA）反应法 。实验步骤和结果计算 见附录 C中C.2 和 B.3。 5 抗寒性评价 DB41/T 13792017 3 5.1 性状相对值计算 性状相对值计算见公式 （ 1）。 Xj = （ xj /CKj式中： ）100% （ 1） Xjx第 j个指标 的性状相对值，作为评价材料 抗寒性的指标； jCK低温处理下 第 j个指标的测定值； j5.2 隶属函数值计算 第 j个指标 的对照处理 测定值。 各参试小麦材料 相对性状的隶属函数值计算 见公式（ 2）和（ 3）。 （ Xij） （ Xij Xmin） /（ Xmax Xmin （ X）（与抗寒性呈正相关的指标）
8、 （2 ） ij）1 （ Xij Xmin） /（ Xmax Xmin式中： ）（与抗寒性呈负相关的指标） （3 ） （ XijX） 第 i个样品，第 j个指标的隶属函数值 ； ijX第 i个样品，第 j个 指标的性状相对值 ； max 和 Xmin5.3 抗寒性评价值计算 某指标性状相对值的最大值和最小值 。 参试小麦材料的冬春季抗寒性评价值 计算见 公式（ 4）。 Di= （ Xij式中： ） /n （ 4） Din测定指标数。 第 i个样品的抗寒性评价值 ； 5.4 抗寒性分级 根据抗寒性 评价 值 D将小麦的抗寒性分为三个等级，见表1 。 表1 小麦抗寒性分级标准 级别 抗寒性评价值（
9、 D） 抗寒性 1 0.65D1 .00 强 2 0.40D0.65 中等 3 0.00D0.40 弱 DB41/T 13792017 4 A A 附 录 A （规范性附录） 小麦叶片可溶性糖含量测定 A.1 试验准备 A.1.1 材料 取被测小麦品种新鲜叶片，剪碎并混匀。 A.1.2 仪器设备 分光光度计；电子分析天平；水浴锅；100 mL容量瓶；试管；漏斗；剪刀；移液管；洗耳球等。 A.1.3 试剂及配制 蒽酮试剂：称取蒽酮 200 mg溶于100 mL浓硫酸中。该试剂不能久贮 ，宜用前配制。 100 gm L-1A.2 实验步骤 蔗糖标准母液：准确称取蔗糖100 mg于烧杯加少量水溶解后
10、，洗入100 mL容量瓶中定容至刻度。 A.2.1 蔗糖标准曲线制作 取6支试管，编号，按表A.1配制每管含量为0 g100 g蔗糖标准液。加入表中试剂后，向各管沿管壁迅速加入蒽酮试剂 6.5 mL，并立即摇动使混合均匀，置试管架上室温下显色，冷却后倒入比色杯，以0号管作空白对照，在 620 nm波长处，以多点校准总量法，制作标准曲线。 表A.1 蔗糖标准液的配制 试剂 管号 0 1 2 3 4 5 蔗糖标准母液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水/mL 2.5 2.3 2.1 1.9 1.7 1.5 每管蔗糖含量/ g 0 20 40 60 80 100 A.2.2 样品提
11、取 取低温胁迫后的新鲜小麦叶片约 1 g，剪碎混匀后放入试管中，加入蒸馏水 10 mL，置于沸水浴中提取20 min ，冷却后过滤入 100 mL容量瓶中，以热水冲洗残渣 23 次，一并滤入容量瓶中，待冷至室温，定容至刻度，即为样品待测液。 A.2.3 可溶性糖含量测定 DB41/T 13792017 5 吸取待测液0.2 mL（含糖量30g80 g），加入试管中，再加蒸馏水 2.3 mL，摇匀。随后沿试管壁迅速加入蒽酮试剂6.5 mL ， 立刻摇动混合均匀，置于试管架上显色，冷却至室温后，以空白管作对照，在 620 nm波长处，按多点校准定量法测定待测管中提取液糖含量。 A.3 结果计算 可
12、溶性糖含量计算见公式（ A.1）。 （ mVa）/( 1000VbW） SS W1000 = （ A.1） 式中： WSS可溶性糖含量 ， mgg-1m提取液中糖含量， g； ； W小麦叶片鲜重， g； VaV提取液总量， mL； b待测液用量， mL。 DB41/T 13792017 6 B B 附 录 B （规范性附录） 小麦叶片SOD活性测定 B.1 试验准备 B.1.1 材料 取被测小麦品种新鲜叶片（大田材料 16:00取样） ，剪碎并 混匀。 B.1.2 仪器设备 分光光度计；高速冷冻离心机；荧光灯（反应试管处照度为4000 Lx）、微量移液器等、离心管数支。 B.1.3 试剂及配制
13、 磷酸缓冲液配制： A液： 0.2 M的KH 2PO4溶液 称取分析纯 KH2PO427.216 g，用蒸馏水定容至 1000 mL。B液：0.2 M的K 2HPO4溶液 称取分析纯 K2HPO43H20.05 M 磷酸缓冲液（ pH=7.8）： A液21.25 mL+B 液228.25 mL定容至 1000 mL。 O45.644 g，用蒸馏水定容至 1000 mL。 130 mM Met(甲硫氨酸 )：取 1.9399 g Met, 用磷酸缓冲液定容至 100 mL；棕色瓶避光4 保存。 750 M NBT（氮蓝四唑）：取 0.06133 g NBT,用磷酸缓冲液定容至 100 mL；棕色
14、瓶避光 4 保存。 100 M EDTA-Na 2： 取0.0372 g EDTA-Na 220 M FD (核黄素 ) ： 0.00753 g FD用蒸馏水定容至 1000 mL。随用随配。棕色瓶避光保存 。 用磷酸缓冲液定容至 1000 mL，棕色瓶避光保存。 B.2 实验步骤 B.2.1 酶液提取 取低温胁迫后的新 鲜小麦叶片约 0.5 g于预冷的研钵中，加 1 mL预冷的 0.05 M磷酸缓冲液（pH=7.8 ）在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使最终体积为5 mL ，在 4 冷冻离心 4000 r/min下离心 20 min，上清液即为SOD 酶粗提液，置于 0 4 下保存待用。 B.2.2
15、 显色反应 取透明度较好的5 mL离心管 4支，2 支为测定管，2支为对照管，1 支做光反应对照，1支做空白（对照、空白不加酶液，以缓冲液代替）。按表B.1依次加入各溶液： 表B.1 各溶液显色反应用量 试剂 用量/mL 终浓度 0.05 M 磷酸缓冲液 1.5 130 mM Met 0.3 13 mM 750 M NBT 0.3 75 M 100 M EDTA -Na 0.3 2 10 M DB41/T 13792017 7 表B.1 各溶液显色反应用量（续） 试剂 用量/mL 终浓度 20 M FD 0.3 2.0 M 酶液 0.05 2 支对照管以缓冲液代替酶液 蒸馏水 0.25 总体积
16、 3.0 混匀后将空白管对照管置黑暗处，其它各管于 4000 Lx日光下反应 20 min，要求各管受光情况一致，根据温度情况来调整反应时间，温度高，反应时间缩短。反应结束后遮光保存。 B.2.3 SOD活性测定与计算 以空白管调零， 560 nm比色，分别测定其它管的吸光度。 B.3 结果计算 已知SOD 活性单位以抑制 NBT光化还原的 50%为一个酶活性单位表示， SOD活性 计算见 公式（ B.1）。 （ ACKAEU） V SOD0.5WV= （ B.1） tA式中: CK USODSOD总活性 ，U g-1A； CKA照光对照管的吸光度； EV样品液总体积 ，mL； 样品管的吸光度
17、； VtW小麦叶片鲜重 ，g 。 测定时的酶液用量 ， mL； DB41/T 13792017 8 C C 附 录 C （规范性附录） 小麦叶片MDA含量测定 C.1 试验准备 C.1.1 材料 取被测小麦品种新鲜 叶片， 剪碎并混匀 。 C.1.2 仪器设备 离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；离心管；移液器（ 1 mL、 5 mL）；洗耳球；剪刀。 C.1.3 试剂 10三氯乙酸； 0.6硫代巴比妥酸（ TBA）溶液；石英砂。 C.2 实验步骤 C.2.1 MDA的提取 称取低温胁迫后的小麦叶片1 g ，加入少量石英砂和 10三氯乙酸 2 mL，研磨至匀浆，再加 8 mL 1
18、0三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000 r/min 离心 10 min，其上清液为丙二醛提取液。 C.2.2 显色反应及测定 取4支干净试管，编号， 3支为样品管（三个重复），各加入提取液 2 mL，对照管加蒸馏水 2 mL，然后各管再加入2 mL 0.6硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应 15 min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在 532、600 和450 nm波长下测定吸光度（ A）值。 C.3 MDA含量计算 C.3.1 反应混合液中 MDA 浓度 反应混合液中 MDA 浓度 计算见 公式（ C.1）。 Cm = 6.45（ A532 A600）0.56 A450式中： （C
19、.1 ） Cm反应混合液中 MDA浓度，mol L-1A； 450A在450 nm 波长下测得的吸光度值 ； 532A在532 nm 波长下测得的吸光度值 ； 600C.3.2 提取液中MDA浓度 在600 nm 波长下测得的吸光度值 。 DB41/T 13792017 9 提取液中MDA 浓度计算见 公式（C.2 ）。 CmVrC/1000 eV= （C.2 ） 式中： d Ce提取液中 MDA浓度， molmL-1V； rV反应液体积， mL； dC.3.3 样品中MDA含量 测定时提取液用量， mL。 样品中 MDA含量计算见 公 式（ C.3）。 CeVWT MDAW = （ C.3） 式中： WMDA样品中 MDA含量，molg-1V； TW小麦叶片鲜重 ，g 。 提取液总量 ，mL ； _
