1、 ICS 67.120.10 B 43 DB12 天 津 市 地 方 标 准 DB 12/ T5272014 奶牛结核病净化技术规范 The technical standard for cleaning of Bovine Tuberculosis in dairy cattle 2014 - 08 - 04发布 2014 - 09 - 01实施天津市市场和质量监督管理委员会 发 布 2014DB12/T 527 I 前 言 本标准的编写符合GB/T 1.1-2009的要求。 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由天津市畜牧兽医局提出。 本标准起草单位：天津市动物疫病预防控制中心。 本标准主
2、要起草人：刘建文、任景江、徐继鹏、王志成、孙涛、李洁、刘莹、曹建新。 1 奶牛结核病净化技术规范 1 范围 本规范规定了奶牛结核病净化的术语和定义、检测方法、净化措施、净化群（场）的认定、净化群（场）的维持。 本规范适用于从事奶牛饲养的单位和个人。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 16548 -2006 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 GB/T 18645-2002 动物结核病诊断技术 牛结核病防治技术规范（农业部，农医发200712
3、号） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛结核病 Bovine Tuberculosis（BTB） 牛结核病（Bovine Tuberculosis, BTB）是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种人兽共患的慢性传染病。 3.2 净化 Cleaning 对某病发病地区采取一系列措施，达到消灭和清除传染源的目标。 3.3 变态反应 Allergy Reaction 变态反应也叫超敏反应，是指机体对某些抗原初次应答后，再次接受相同抗原刺激时，发生的一种以机体生理功能紊乱或组织细胞损伤为主的特异性免疫应答。 3.4 -干扰素 Interferon Ga
4、mma（IFN-） 2014DB12/T 527 2 -干扰素是指主要由淋巴细胞（如自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、CD4 Th1和CD8 T淋巴细胞、效应T细胞）分泌的促炎性细胞因子。 4 检测方法 4.1 牛型结核分枝杆菌PPD（提纯蛋白衍生物）皮内变态反应试验（即牛提纯结核菌素皮内变态反应试验）按GB/T 18645-2002 规定操作。 4.2 -干扰素ELISA试验作为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验的补充试验（见附录A）。 5 净化措施 5.1 检测 5.1.1 成年牛每年春秋两季各进行一次检测。 5.1.2 对奶牛群（场）存栏奶牛按100%比例进行检测。 5.1.3 初生犊牛
5、应于20日龄时进行第一次检测，100120 日龄时，进行第二次检测。 5.1.4 检测时，首先用牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验进行检测。 5.1.5 凡牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验阳性或疑似反应者，应3 d后进行-干扰素ELISA试验检测，如-干扰素ELISA试验为阳性，按照本规范5.3规定处理；如为阴性，间隔3个月进行复检。 5.1.6 连续两次检测均为阴性者视为阴性牛。 5.2 隔离 牛型结核分枝杆菌PPD 皮内变态反应试验和-干扰素反应试验结果阳性或可疑牛须与受威胁的同群牛隔离，隔离场地周围应有自然屏障或人工栅栏。 5.3 阳性牛的处理 5.3.1 扑杀 对确认的结
6、核病阳性牛全部扑杀。 5.3.2 无害化处理 扑杀的结核病阳性牛，应按照GB 16548-2006 进行无害化处理。 5.4 消毒 5.4.1 紧急消毒 奶牛群中检出并剔出结核病阳性牛后，对污染的场所、用具、物品进行严格消毒。饲养场的金属设施、设备采取火焰、熏蒸等方式消毒；饲养场的圈舍、场地、车辆等，可选用2%烧碱等有效消毒药消毒；饲养场的饲料、垫料可采取深埋发酵处理或焚烧处理；粪便采取堆积密封发酵方式，以及其他相应的有效消毒方式。 5.4.2 日常消毒 饲养场及牛舍出入口处，应设置消毒池，内置有效消毒剂，如3%5%来苏儿溶液或20石灰乳等。消毒药要定期更换，以保证一定的药效。牛舍内的一切用具
7、应定期消毒；产房每周进行一次大消毒，分娩室在临产牛生产前及分娩后各进行一次消毒。 5.5 引种 2014DB12/T 527 3 5.5.1 异地调运的奶牛，必须来自于非疫区，应当符合农业部规定的健康标准。 5.5.2 跨省、自治区、直辖市引进奶牛及其胚胎和精液，应按跨省调运乳用种用动物产地检疫规程向输入地动物卫生监督机构申请办理审批手续。 5.5.3 检疫合格的奶牛经市人民政府指定通道进入，运输工具应接受防疫消毒。调入后应按农业部动物检疫管理办法相关规定隔离饲养30 d，经隔离检疫合格的方可混群饲养。 5.5.4 进口奶牛及其胚胎和精液，按照进境动植物检疫审批管理办法须向国家质检总局提出申请
8、，办理审批手续，经检疫合格入境后，需隔离45 d，经检疫合格方能入关。 5.6 从业人员 从事奶牛饲养和管理的人员每年要进行健康检查，发现患有结核病的应调离岗位。 6 净化群（场）的认定 奶牛群（场）同时满足以下要求，认定为达到净化标准。 6.1 连续2年以上无临床病例。 6.2 按本规范5.1的规定连续2次以上全群检测结果均为阴性。 6.3 引进奶牛及其胚胎和精液的，符合本规范5.5的规定。 7 净化群（场）的维持 7.1 达到净化标准的奶牛群（场）每年进行检测。 7.2 发现阳性牛按照本规范5.3规定处理，同群牛按本规范5.1.2要求检测。 7.3 按本规范5.5规定对异地调运奶牛进行检疫
9、。 7.4 按本规范5.4.2规定做好日常消毒。 7.5 按本规范5.6规定做好从业人员管理工作。 2014DB12/T 527 4 附 录 A （资料性附录） -干扰素ELISA试验 A.1 试验材料 A.1.1 牛结核分枝杆菌-干扰素ELISA试剂盒（内含酶标板、牛-干扰素阳性对照、牛-干扰素阴性对照、血浆稀释缓冲液、20倍浓缩洗液、100倍浓缩酶标结合物、5倍浓缩酶标结合物稀释液、底物缓冲液、100倍浓缩的显色剂溶液和终止液） A.1.2 牛型提纯结核菌素（牛型PPD） A.1.3 禽型提纯结核菌素（禽型PPD） A.1.4 肝素钠真空管 A.1.5 孔组织培养板 A.1.6 单道可调移
10、液器及配套吸头（20L-200L、100L-1000L、1mL-10mL） A.1.7 道移液器及配套吸头（50L-300L） A.1.8 量筒（100mL、1L、2L） A.1.9 有盖离心管（1.5 mL） A.1.10 恒温CO2培养箱 A.1.11 酶标仪 A.1.12 洗板机 A.2 试剂配制 A.2.1 磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 M pH7.2) 取磷酸氢二钠1.096 g、磷酸二氢钠0.316 g、氯化钠8.5 g，用蒸馏水定容至1000 mL，调pH至7.2，灭菌后使用。 A.2.2 酶标结合物 用去离子水或蒸馏水重新溶解100倍浓缩的冻干酶标结合物。 A.2.3 酶标结
11、合物稀释液 用去离子水或蒸馏水重新溶解5倍浓缩的酶标结合物稀释液。 A.2.4 牛-干扰素阳性对照 用1 mL去离子水或蒸馏水重新溶解。 A.2.5 牛-干扰素阴性对照 用1 mL去离子水或蒸馏水重新溶解。 A.2.6 洗液 用去离子水或蒸馏水重新溶解20倍浓缩的洗液。 A.2.7 显色剂溶液 将100倍浓缩的显色剂溶液用底物缓冲液做100倍稀释配制。 A.3 试验方法 A.3.1 临床样本采集及预处理 A.3.1.1 样本的采集 牛静脉无菌采血5 mL，放入肝素钠真空管中，轻轻颠倒几次混合血液，形成肝素钠抗凝全血。出现凝血的全血样品不可用。 A.3.1.2 肝素钠抗凝全血的运送 肝素钠抗凝全
12、血应在周围环境温度（225）运送，并且最好在采血后8 h（最长不超过30 h）内用于检测。 A.3.1.3 定量吸取肝素钠抗凝全血 分装前轻轻颠倒试管，充分混匀血液样品。将抗凝血加入24 孔组织培养板，每份抗凝血样品加3孔，每孔加1.5 mL。 A.3.1.4 加入牛型PPD、禽型PPD和PBS 向24 孔培养板中每份样品对应的3个孔分别无菌加入100 L牛型PPD、禽型PPD 和PBS（阴性抗原对照），充分混匀。 A.3.1.5 全血孵育过夜 将全血培养板置CO2培养箱内，37 孵育18 h（全血可接受培养时间为162014DB12/T 527 5 24 h）。 A.3.1.6 收获血浆 经
13、过18 h 培养，用移液器小心吸取约400 L 的上层血浆， 转入独立的1.5 mL 离心管中，待测。吸取血浆时应尽量避免吸入细胞。待测样品可立即用于试验或-20 冷冻贮存。 A.3.2 检测方法 A.3.2.1 试验前将酶标板和所有试剂恢复到室温，试剂充分混匀。 A.3.2.2 向酶标板中的96孔中分别加入50 L血浆稀释缓冲液， 再向相应孔中加入50 L 待测样品和牛-干扰素阴、阳性对照样品。对照样品应最后加入。充分振荡1min，彻底混匀。封板，室温（225）孵育（605）min。用洗板机洗涤6 次， 将酶标板放在干净的滤纸上拍打几次，尽量除去残留的洗液。 A.3.2.3 每孔加入100
14、L稀释好的酶标结合物，充分振荡混匀。室温孵育（605 min），洗涤6 次。 A.3.2.4 每孔加入100 L 新鲜配制的显色剂溶液，充分振荡混合。室温避光孵育30 min。 A.3.2.5 迅速加入50 L 终止液，轻轻摇动混匀。 A.3.2.6 终止后5 min 内读出OD450 值，然后用OD 450值计算结果。 A.3.3 结果判定 A.3.3.1 满足以下2个条件试验方成立 牛-干扰素阴性对照OD450 值0.7。 A.3.3.2 计算每头动物所有样品（包括加入牛型PPD、禽型PPD 和PBS） 的OD450 值 阳性=牛型PPD的OD450 值-禽型PPD的OD450 值0.1，且牛型PPD的OD450 值-PBS对照的OD450 值0.1。 阴性=牛型PPD的OD450 值-禽型PPD的OD450 值0.1，且牛型PPD的OD450 值-PBS对照的OD450 值0.1。 _ 2014DB12/T 527
