1、ICS 65.020.20 B 05 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 17672013 苹果品种 DNA指纹鉴定 2013 - 09 - 05 发布 2013 - 09 - 30 实施河北省质量技术监督局 发 布DB13/T 17672013 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由河北省林业厅提出。 本标准起草单位：河北农业大学。 本标准主要起草人：刘兴菊、杨敏生、梁海永、张军、左立辉、李雪雁、姚伟明、杨立华、韩志校魏姗姗、甄红伟、王瑞霞。 DB13/T 17672013 1 苹果品种 DNA指纹鉴定 1 范围 本标准规定了苹果品种DNA
2、指纹鉴定的方法及判定标准。 本标准适用于苹果品种鉴定及河北省苹果品种DNA指纹库的建立。 2 原理 不同苹果品种由于遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可经过PCR扩增、电泳分离、显色程序绘制的DNA指纹图谱加以区分，从而对不同品种进行鉴定。从苹果幼苗、叶片等组织中提取总DNA，利用SSR引物对位于不同染色体上的SSR位点进行PCR扩增，不同碱基长度的PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（或通过DNA分析仪、测序仪进行分离），并通过染色显示DNA指纹谱带类型。 3 仪器设备及试剂 苹果品种DNA指纹鉴定所需仪器设备及试剂名单见附录A。 4 溶液配制 苹果品种D
3、NA指纹鉴定相关溶液配制方法见附录B。 5 鉴定方法 5.1 样品准备 5.1.1 取样量 每份送检样品至少检测3个个体，每个个体至少1g，对一致性差的样品应至少检测5个个体。 5.1.2 品种比较方式 a) 成对品种的比较 送检样品提供两份，一份为待检品种，一份为对照品种。将待检品种与对照品种直接进行成对比较。杂交后代需提供母本与父本的样品。 b) 品种与DNA指纹库入库品种的比较 送检样品可提供一份。将待检样品与DNA指纹库所有入库品种的指纹进行比较，筛选出指纹最相似或相同的品种作为待检品种的近似品种，然后将待检品种与近似品种直接进行成对比较。 5.2 DNA提取 DB13/T 17672
4、013 2 5.2.1 宜采用改良的CTAB法。取200mg干净叶片置入1.5mL离心管中，加入500LDNA提取液研磨碎，并加1mL洗涤液及30L-巯基乙醇，充分摇匀后置冰上5min，于4，12000 g离心8min后，洗涤一次，弃上清，再加700L预热的CTAB缓冲液,充分混匀后，于65水浴60min，其间颠倒几次。然后于室温冷却4 min5min，取上清,加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25241),混匀抽提，室温静置5min，于室温12000 g离心8min。上清液移于一新的1.5mL离心管中，加入等体积氯仿异戊醇(241)，充分混匀后室温静置5min，室温12000g离心8min，取上清
5、，重复加等体积氯仿异戊醇(241)抽提，取上清加入等体积氯仿抽提一次，取上清液，加入2倍体积的无水乙醇(-20)，轻轻混匀后在-20沉淀30分钟以上，12000 g离心10min，将所得沉淀风干后溶于100L水中，置4冰箱备用。 5.2.2 其它保证DNA质量的方法也可采用，应用前需要通过微量紫外分光光度计进行DNA质量与浓度检测。 5.3 PCR扩增 5.3.1 SSR扩增 基本核心引物名单见附录C。 5.3.2 反应体系 反应液体积为20L，组分配制应符合表1的规定（或按比例减少至10L）。 表1 PCR反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 反应体积L ddH2O 13.35 10buffe
6、r 10 1 2 MgCl225mmol/L 2.5mmol/L 2 dNTP 2.5mmol/L 0.15mmol/L 1.2 Taq酶 5U/L 1U 0.2 引物 20mol/L 0.25mol/L 0.25 DNA 3050ng/L 1.52.5 ng/L 1 5.3.3 反应程序 94预变性5min；94变性50s，55退火50s，72延伸50s,共30个循环；72延伸7min，4保存。 5.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.4.1 清洗玻璃板 用自来水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂上0.5 mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5
7、 mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。 5.4.2 组装电泳板 待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。 DB13/T 17672013 3 5.4.3 灌胶 在100 mL 4 .5%PAGE胶中加入TEMED和25%过硫酸铵各100L，迅速混匀后灌胶。待胶流动到下部，在上部轻轻插入梳子，使其聚合至少lh以上。灌胶过程中防止出现气泡。 5.4.4 预电泳 在正极槽中加入1TBE缓冲液600 mL，在负极槽(上槽)加入预热至65的ITBE缓冲液600 mL，拔出梳子。90W恒功率预电泳10 min20 min。 5.4.5 变性 在20L PCR样品中加入4L6加样缓冲
8、液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序: 95变性5min，4冷却10 min以上。 5.4.6 电泳 用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插入样品梳子。每一个加样孔点入5L样品。80W恒功率电泳至上部的指示带(二甲苯青)到达胶板的中部(约40 min)。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶会紧贴在长板上。 5.5 银染 5.5.1 银染流程图 6 结果及判定 固定液中轻轻晃动3 min 双蒸水快速漂洗1次，不超过10 s 银染 染色液中染色约1015 min 双蒸水快速漂洗1次，不超过10 s 显影液中轻轻晃动至带纹出现 定影 固定液中定影5 min 双蒸水漂洗1 min 双蒸水快速漂洗1次，
9、不超过30 s DB13/T 17672013 4 6.1 数据表示 以多数个体具有的谱带即主带作为品种的特征谱带，当无法判断主带时，给出各种谱带所占的比率。谱带记录方式:每个核心引物的所有谱带按扩增片段从大到小的顺序编号，用二位代码描述(依次为01、02 .)，并确定代表每条谱带的一套标准品种。每个待测品种在每个引物位点上的谱带号用四位代码描述，参照标准品种确定待测品种的谱带号。 示例1：在一个核心引物上仅有一条谱带02，品种在该引物位点的谱带代码为0202； 示例2：在一个核心引物上有两条谱带02和03，品种在该引物位点的谱带代码为0203。 6.2 检测及判定标准 6.2.1 先用17对
10、基本核心引物检测，获得待测品种在17个引物位点的DNA指纹谱带数据，利用17个位点的DNA指纹谱带数据进行品种间比较。亲缘关系较近难以区分时可附加17个参考位点。 a) 品种间差异位点数2，判定为不同品种； b) 品种间差异位点数1，判定为相近品种； c) 品种间差异位点数0，判定为相同或极近似品种。 6.2.2 对b和c的情况，必要时继续用17对扩展核心引物进行检测，利用34个位点的DNA指纹谱带数据进行品种间比较： a) 品种间差异位点数2，判定为不同品种； b) 品种间差异位点数1，判定为相近品种； c) 品种间差异位点数0，判定为相同或极近似品种。 6.3 鉴定报告 鉴定报告书格式见附
11、录D。 DB13/T 17672013 5 A A 附 录 A （规范性附录） 仪器设备及试剂 A.1 仪器设备 A.1.1 PCR核酸扩增仪:规格为96孔; A.1.2 序列分析电泳槽; A.1.3 高压电泳仪:规格为3000 V , 400 mA, 400 W ; A.1.4 水平摇床; A.1.5 胶片观察灯; A.1.6 电子天平; A.1.7 微量加样器; A.1.8 磁力搅拌器; A.1.9 高速离心机 A.1.10 微量紫外分光光度计 A.1.11 高压灭菌锅; A.1.12 pH酸度计。 A.2 试剂 所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。 A.2.1 乙二胺四乙酸二钠; A
12、.2.2 Tris碱; A.2.3 盐酸; A.2.4 氢氧化钠; A.2.5 10 Buffe:缓冲液; A.2.6 四种脱氧核苷酸:4 dNTP; A.2.7 Taq DNA聚合酶; A.2.8 SSR引物; A.2.9 矿物油; DB13/T 17672013 6 A.2.10 去离子甲酞胺; A.2.11 澳酚蓝; A.2.12 二甲苯青FF; A.2.13 甲叉双丙烯酰胺; A.2.14 丙烯酰胺; A.2.15 硼酸; A.2.16 脲素; A.2.17 亲和硅烷:97 %; A.2.18 剥离硅烷:2%二甲基二氯硅烷; A.2.19 无水乙醇; A.2.20 四甲基乙二胺(TEM
13、ED) ; A.2.21 过硫酸铵; A.2.22 冰醋酸; A.2.23 硝酸银; A.2.24 甲醛溶液:37 %。 DB13/T 17672013 7 B B 附 录 B （规范性附录） 溶液配制 B.1 DNA提取溶液的配制 B.1.1 0.5mol/L EDTA溶液 186.lg Na2EDTA2H2O溶于800 mL水中，用固体NaOH调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌。 B.1.2 1 mol/L Tris-HCI溶液 60.55gTris碱溶于适量水中，加HCI调pH至8.0定容至500 mL，高压灭菌。 B.1.3 洗涤液 100 mM Tris-HC,l pH 8
14、. 0; 50 mM EDTA; 1M NaC;l 1%-巯基乙醇; 2% PVP B.1.4 CTAB 提取缓冲液 100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl，2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的-巯基乙醇(注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌之后加入巯基乙醇) B.1.5 酚/氯仿/异戊醇 25：24：1。 B.1.6 TE缓冲液1 lmol/L Tris-HC1 5mL，0.5 mol/L EDTA 1 mL，加HCI调pH至8.0，定容至500mL。 B.1.7 TE缓冲液2 lmol/L
15、Tris-HC1 5rnL，0.5mol/L EDTA 1 mL，0.5 mol/L HCI 100 mL，定容至500 mL。 B.1.8 5 mol/L NaCI溶液 146g固体NaCI溶于水中，加水定容至500 mL。 B.2 PCR扩增溶液的配制 B.2.1 dNTP 用超纯水分别配制A、G、C、T终浓度100 mmol/L的储存液。各取20L混合，用超纯720L定容至终浓度2.5mmol/L each的工作液。也可直接购买浓度2.5mmol/L each的工作液。 B.2.2 SSR引物 用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均 40mol/L 的储存液，等体积混合成 20mo1/L
16、的工作DB13/T 17672013 8 液。注:干粉配制前应首先快速离心。 B.2.3 6加样缓冲液 去离子甲酞胺49 mL，0.5 mol/L的EDTA溶液(pH8.0)1 mL，澳酚兰0.125g，二甲苯青0.125g。 B.3 变性聚丙烯酞胺凝胶电泳溶液的配制 B.3.1 40%PAGE胶 丙烯酞胺190g和甲叉双丙烯酚胺10g, 定容至500 mL。 B.3.2 4.5%PAGE胶 尿素450g，10 TBE缓冲液100 mL，40%PAGE胶112.5 mL，定容至1000mL。 B.3.3 Bind缓冲液 49.75 mL无水乙醇和250L冰醋酸，加水定容至50 mL。 B.3.
17、4 亲和硅烷工作液 在1mLBind缓冲液中加入5L Bind原液，混匀。 B.3.5 剥离硅烷工作液 2%二甲基二氯硅烷。 B.3.6 25%过硫酸铵溶液 0.25g过硫酸铵溶于1 mL超纯水中。 B.3.7 10TBE缓冲液 Tris碱108g，硼酸55g，0.5mol/L EDTA溶液37 mL，定容至1000 mL。 B.3.8 1TBE缓冲液 10TBE缓冲液500mL，加水定容至5000mL。 B.4 银染溶液的配制 B.4.1 固定液 100 mL冰醋酸，加水定容至1000 mL。 B.4.2 染色液 2g硝酸银，加水定容至1000 mL。 B.4.3 显影液 1000mL蒸馏水
18、中加入30 g氧氧化钠和5 mL甲醛。 DB13/T 17672013 9 C C 附 录 C （规范性附录） 基本核心引物名单 标记位点 染色 推荐 正向引物序列（5-3） 反向引物序列（5-3） CH03g12 1 I GCGCTGAAAAAGGTCAGTTT CAAGGATGCGCATGTATTTG CH02b10 2 I CAAGGAAATCATCAAAGATTCAAG CAAGTGGCTTCGGATAGTTG CH03g07 3 I AATAAGCATTCAAAGCAATCCG TTTTTCCAAATCGAGTTTCGTT CH02h11a 4 I CGTGGCATGCCTATCAT
19、TTG CTGTTTGAACCGCTTCCTTC CH03a09 5 I GCCAGGTGTGACTCCTTCTC CTGCAGCTGCTGAAACTGG CH03d12 6 I GCCCAGAAGCAATAAGTAAACC ATTGCTCCATGCATAAAGGG CH02a04 7 I GAAACAGGCGCCATTATTTG AAAGGAGACGTTGCAAGTGG CH01c06 8 I TTCCCCATCATCGATCTCTC AAACTGAAGCCATGAGGGC CH01f03b 9 I GAGAAGCAAATGCAAAACCC CTCCCCGGCTCCTATTCTAC CH02
20、a08 10 I GAGGAGCTGAAGCAGCAGAG ATGCCAACAAAAGCATAGCC CH02d08 11 I TCCAAAATGGCGTACCTCTC GCAGACACTCACTCACTATCTCTC CH01F02 12 I ACCACATTAGAGCAGTTGAGG CTGGTTTGTTTTCCTCCAGC CH05c04 13 I CCTTCGTTATCTTCCTTGCATT GAGCTTAAGAATAAGAGAAGGGG CH03d08 14 I CATCAGTCTCTTGCACTGGAAA TAGGGCTAGGGAGAGATGATGA CH02c09 15 I TT
21、ATGTACCAACTTTGCTAACCTC AGAAGCAGCAGAGGAGGATG CH05a04 16 I GAAGCGAATTTTGCACGAAT GCTTTTGTTTCATTGAATCCCC CH01h01 17 I GAAAGACTTGCAGTGGGAGC GGAGTGGGTTTGAGAAGGTT Hi02c07 1 II AGAGCTACGGGGATCCAAAT GTTTAAGCATCCCGATTGAAAGG CH02c02a 2 II CTTCAAGTTCAGCATCAAGACAA TAGGGCACACTTGCTGGTC MS14h03 3 II CGCTCACCTCGTAGA
22、CGT ATGCAATGGCTAAGCATA CH04e02 4 II GGCGATGACTACCAGGAAAA ATGTAGCCAAGCCAGCGTAT CH05f06 5 II TTAGATCCGGTCACTCTCCACT TGGAGGAAGACGAAGAAGAAAG CH03d07 6 II CAAATCAATGCAAAACTGTCA GGCTTCTGGCCATGATTTTA CH04e05 7 II AGGCTAACAGAAATGTGGTTTG ATGGCTCCTATTGCCATCAT CH01f09 8 II ATGTACATCAAAGTGTGGATTG AATTCCAATTTCAG
23、AACAGG CH01h02 9 II AGAGCTTCGAGCTTCGTTTG ATCTTTTGGTGCTCCCACAC CH02B03b 10 II ATAAGGATACAAAAACCCTACACAG GACATGTTTGGTTGAAAACTTG CH04g07 11 II CCCTAACCTCAATCCCCAAT ATGAGGCAGGTGAAGAAGGA CH04d02 12 II CGTACGCTGCTTCTTTTGCT CTATCCACCACCCGTCAACT CH03a08 13 II TTGGTTTGCTAGGAAAAGAAGG AAGTTTATCGGGCCTACACG CH03
24、g04 14 II ATGTCCAATGTAGACACGCAAC TTGAAGATGGCCTAACCTTGTT CH02d11 15 II AGCGTCCAGAGCAACAGC AACAAAAGCAGATCCGTTGC CH04f10 16 II GTAATGGAAATACAGTTTCACAA TTAAATGCTTGGTGTGTTTTGC CH05g03 17 II GCTTTGAATGGATACAGGAACC CCTGTCTCATGGCATTGTTG 注：I型标记含首先采用的17对引物，II型标记含候补采用的17对引物。 DB13/T 17672013 10 D D 附 录 D （规范性附录） 苹果品种DNA指纹鉴定报告书 共 页，第 页（附图 页） 样品名称： 样品编号： 样品数量： 样品性状： 检验项目： 检验依据： 主要仪器设备： 检验条件： 检验时间： 送检单位： 送样时间： 联系地址： 联系电话： 检验内容及结果： 1、 受检样品性状 2、 检验方法 3、 结果 4 、结论 承检单位： 地 址： 邮政编码： 联 系 人： 联系电话： 主 检 人： 技术负责人： 检验日期： 年 月 日 _
