1、November 2015DEUTSCHE NORM Preisgruppe 7DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 85.060!%EmM“2347442www.din.deDIN 54383Prfung von Papier und Pappe Bestimmung von Clo
2、stridiensporenTesting of paper and board Determination of spores of clostridiumEssais des papiers et cartons Dtermination des spores de clostridiumAlleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 BerlinErsatz frDIN 54383:197911www.beuth.deGesamtumfang 9 SeitenDDIN-Normenausschuss Papier, Papp
3、e und Faserstoff (NPa)DIN 54383:2015-11 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich . 4 2 Normative Verweisungen . 4 3 Begriffe 4 4 Kurzbeschreibung . 4 5 Reagenzien und Nhrmedien 4 5.1 Allgemeines . 4 5.2 Reagenzien . 4 5.3 Nhrmedien . 5 5.3.1 Clostridien-Differential-Bouillon (DRCM) 5 5.3.2 Pepto
4、n-Lsung 5 6 Gerte und Hilfsmittel . 5 7 Proben . 6 7.1 Probenahme 6 7.2 Anzahl der Proben . 6 7.3 Probenvorbereitung . 7 7.3.1 Zubehr . 7 7.3.2 Trockengehaltsbestimmung 7 7.3.3 Herstellen der Basissuspension . 7 7.3.4 Herstellen der fertigen Produkte 7 8 Durchfhrung 7 9 Angabe der Ergebnisse 8 10 Pr
5、fbericht . 8 Literaturhinweise . 9 DIN 54383:2015-11 3 Vorwort Dieses Dokument wurde vom Arbeitsausschuss NA 074-02-01 AA Chemisch-technische Prfverfahren fr Papier, Pappe, Faserstoff und Chemiezellstoff“ im DINNormenausschuss Papier, Pappe und Faserstoff (NPa), erarbeitet. Es wird auf die Mglichkei
6、t hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. DIN ist nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. Warnung Die in dieser Norm beschriebenen Vorgnge knnen zu einer Anreicherung von pathogenen Mikroorganismen fhren, die b
7、ei fehlenden Vorsichtsmanahmen gesundheitsschdigend wirken knnen. Diese Norm enthlt keine Ausfhrungen zu Gesundheitsgefhrdungen, Sicherheits- oder Umweltaspekten und Gesetzgebungen, die mit ihrer Anwendung zusammenhngen. Der Anwender dieser Norm ist dafr verantwortlich, vor Verwendung der Norm geeig
8、nete Manahmen zur Sicherheit, zum Gesundheits- und Infektionsschutz zu treffen, sowie gesetzliche Einschrnkungen einzuhalten. nderungen Gegenber DIN 54383:1979-11 wurden folgende nderungen vorgenommen: a) nderungen des Deutschen Titels und Streichung der Verfahrensbezeichnung; b) Aktualisierung der
9、Normativen Verweisungen; c) vollstndige berarbeitung des Abschnittes 5 Reagenzien und Nhrmedien“; d) redaktionelle nderungen. Frhere Ausgaben DIN 54383: 1979-11 DIN 54383:2015-11 4 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt ein Verfahren zur Bestimmung von Clostridien in Papier, Karton, Vollpappe und Wellp
10、appe fest. Der Anwendungsbereich erstreckt sich auf die Verwendung dieser Materialien als Lebensmittelpackstoffe, die unbeschichtet und zur Verpackung von nicht vorverpackten, direkt zum Verzehr oder Verbrauch bestimmten Lebensmitteln vorgesehen sind. 2 Normative Verweisungen Die folgenden Dokumente
11、, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nder
12、ungen). DIN EN 26461-1, Wasserbeschaffenheit; Nachweis und Zhlung der Sporen sulfitreduzierender Anaerobier (Clostridien); Teil 1: Flssigkeitsanreicherung DIN EN ISO 186, Papier und Pappe Probenahme zur Bestimmung der Durchschnittsqualitt DIN EN ISO 638, Papier, Pappe und Faserstoff Bestimmung des T
13、rockengehaltes Wrmeschrankverfahren 64 LFGB L 59.00-4 Ph. Eur. Europisches Arzneibuch1)3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gilt der folgende Begriff. 3.1 Clostridien weit verbreitete, anaerob lebende Mikroorganismen, die Sporen bilden, welche durch 30 min langes Erhitzen bei 75 C nicht abge
14、ttet werden 4 Kurzbeschreibung Die zu untersuchende Probe wird in Peptonlsung aufgeschlagen. Von der so erhaltenen Basissuspension werden definierte Mengen zu Clostridien-Differential-Bouillon gegeben. Diese Anstze werden im Wasserbad auf 75 C erhitzt und danach 3 d bzw. 7 d bei 30 C bebrtet. Die ni
15、edrigste Verdnnungsstufe, bei der eine Verfrbung des Nhrmediums aufgetreten ist, wird angegeben und daraus die entsprechende Packstoffmenge in g errechnet. 5 Reagenzien und Nhrmedien 5.1 Allgemeines Es werden nur Reagenzien von anerkannter analytischer Qualitt und nur destilliertes Wasser oder Wasse
16、r entsprechender Reinheit verwendet. 5.2 Reagenzien Paraffin, dickflssig, Qualitt nach Ph. Eur.2)Das Paraffin wird 15 min bei 150 C sterilisiert. 1)Zu beziehen bei: Deutscher Apotheker Verlag, Birkenwaldstr. 44, 70191 Stuttgart 2)Ph. Eur.: Europisches Arzneibuch DIN 54383:2015-11 5 5.3 Nhrmedien 5.3
17、.1 Clostridien-Differential-Bouillon (DRCM)3) 10,0 g Pepton; 10,0 g Fleischextrakt; 5,0 g Natriumacetat; 1,5 g Hefeextrakt; 1,0 g Strke; 1,0 g D(+)-Glucose; 0,5 g L(+)-Cystein; 0,4 g Natriumdisulfit; 0,7 g Eisen(III)-ammoniumcitrat; 0,002 g Resazurin; pH 7,1 0,1 . Zusammensetzung des Nhrmediums nach
18、 64 LFGB (Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch), L 59.00-4, und DIN EN 26461-1. DRCM-Bouillon ist als Trockennhrmedium kommerziell erhltlich (z. B. Oxoid, Sifin u. a.) und sollte nach Angaben des Herstellers angesetzt werden. Jeweils 10 ml des Nhrmediums werden in Reagenzglser gefllt und mit auf
19、gesetztem Schraubverschluss im Autoklaven 15 min bei 120 C sterilisiert. Die Schraubverschlsse sind unmittelbar nach dem Sterilisieren, d. h. bei noch heien Nhrmedien, fest anzuziehen. Das Medium ist bei +4 C zu lagern. Eine Lagerungsdauer von 14 d sollte nicht berschritten werden. 5.3.2 Pepton-Lsun
20、g 1,0 g Pepton aus Fleisch, tryptisch verdaut, wird in 1 000 ml Wasser gegeben und gelst. Die frisch angesetzte Lsung wird 15 min bei 120 C sterilisiert. Die Lsung muss bei Zimmertemperatur gelagert innerhalb von 8 d verbraucht werden. Wird die Lsung bei +4 C gelagert, darf eine Lagerungsdauer von 1
21、4 d nicht berschritten werden. Es ist auch mglich, die Lsung ber Membranfilter zu sterilisieren. 6 Gerte und Hilfsmittel bliches Laborgert und zustzlich: Brutschrank, regelbar auf eine Temperatur von (30 1) C (diese Temperatur muss an allen Stellen im Brutraum gleichmig sein); Autoklav fr einen Betr
22、iebsdruck bis 3,5 bar und eine Sterilisationstemperatur bis 134 C. Er muss so eingerichtet sein, dass eine Mindesttemperatur von (120 2) C eingehalten werden kann; 3)DRCM = Differential Reinforced Clostridial Medium DIN 54383:2015-11 6 Dampftopf; Heiluftsterilisator fr eine Sterilisationstemperatur
23、von 160 C bis 170 C; Schere, z. B. Gipsschere oder hnlich starke Schere aus nicht rostendem Stahl; Aufschlaggert; 200-ml-Laborglasflaschen mit 100-ml-Markierungen; Wgeglser, Durchmesser 38 mm, Hhe 70 mm, z. B. nach DIN 12605; ANMERKUNG Es ist empfehlenswert, diese Glser mit laufender Nummer versehen
24、 zu beziehen. Membranfiltrationsgert; Gasbrenner oder Spirituslampe; Reagenzglser (etwa 18 mm 150 mm) mit Schraubverschluss, sterilisierbar; Wasserbad, regelbar auf (75 2) C; Pinzetten oder Kornklammern; Nhrbodenflaschen, 300 ml, z. B. mit Kapsenbergkappen; Reagenzglasschttler; Anaerobier-Topf; 250-
25、ml-Becher, z. B. Becher DIN 12331 H 250; 1000-ml-Becher, z. B. Becher DIN 12331 H 1000; 10-ml-Vollpipette, z. B. Vollpipette Klasse B mit einem Nennvolumen von 10 ml nach DIN EN ISO 648; Messpipetten mit weitem Ausfluss, die es gestatten, Flssigkeitsvolumina von 0,1 ml bis 2,0 ml zu messen. 7 Proben
26、 7.1 Probenahme Die Probenahme ist nach DIN EN ISO 186 durchzufhren. Es drfen nur die Rnder der Proben angefasst werden. Die entnommenen Proben mssen sofort aufeinander in ein sterilisiertes Probenahmegef gelegt werden. Alternativ darf dazu eine zuvor abgeflammte Aluminiumfolie verwendet werden. 7.2
27、 Anzahl der Proben Die Anzahl der Prfmuster je Entnahmeeinheit muss mindestens 10 betragen. Bei der Probenahme ist zu beachten, dass ausreichendes Versuchsmaterial fr die Trockengehaltsbestimmung mit entnommen wird. DIN 54383:2015-11 7 7.3 Probenvorbereitung 7.3.1 Zubehr Alle Gerte und Hilfsmittel,
28、die mit den Kulturmedien oder dem Probenmaterial in Berhrung kommen, sind mit einem Dampf-Sterilisator bei einer Temperatur von 121 C fr 15 min oder in einem Heiluftsterilisator bei 160 C fr 2 h zu sterilisieren. Bei Serienanalysen drfen Pinzetten bzw. Kornklammern, Scheren und der Schaft des Aufsch
29、laggertes auch durch Abflammen sterilisiert werden. 7.3.2 Trockengehaltsbestimmung Von Prfstcken des zu untersuchenden Materials ist der Trockengehalt nach DIN EN ISO 638 zu bestimmen. 7.3.3 Herstellen der Basissuspension Das Probenmaterial darf nur mit sterilen Pinzetten oder Kornklammern, nicht ab
30、er mit den Fingern berhrt werden. Je Probe werden mindestens 10 Prfmuster eingesetzt. Aus jedem werden mithilfe einer sterilen Schere etwa 1,5 g Prfstcke mit einer Gre von etwa 15 mm 15 mm zugeschnitten. Anhand des ermittelten Trockengehaltes der Probe wird die lufttrockene Einwaage berechnet, die m
31、glichst genau 1 g ofentrockenes Untersuchungsmaterial betragen muss. Die berechnete Masse ist unter sterilen Bedingungen in ein steriles Wgeglas einzuwgen. Die Einwaage wird in eine sterile Laborglasflasche gegeben, die mit 99 ml Peptonlsung gefllt ist. Mit einem sterilen Aufschlaggert werden die Ve
32、rsuchsstcke zerfasert. Nach einer Aufschlagzeit von 1 min wird meist eine ausreichende, sehr feine Verteilung erhalten, die sich verhltnismig langsam absetzt. Bei der Entnahme ist dafr zu sorgen, dass eventuell abgesetzte Fasern neu aufgewirbelt werden. Dies erfolgt am besten mit der zur Entnahme be
33、stimmten sterilen Pipette. Die erhaltene Faserstoffsuspension stellt die Basissuspension fr die weitere Prfung dar. 7.3.4 Herstellen der fertigen Produkte Jeweils 0,1 ml, 0,25 ml, 0,5 ml, 0,75 ml, 1,0 ml, 1,5 ml und 2,0 ml der Basissuspension werden den Reagenzglsern mit den Nhrmedien zugesetzt und
34、mit Hilfe des Reagenzglasschttlers gleichmig verteilt. Nach dem Verteilen wird sicherheitshalber mit 1 ml sterilem Paraffin berschichtet. Die Schraubverschlsse der Reagenzglser drfen nicht mehr fest angezogen werden, damit sich bildende Gase entweichen knnen. Die befllten Reagenzglser werden 30 min
35、bei 75 C im Wasserbad erhitzt und danach zur sofortigen Abkhlung in kaltes Wasser getaucht. Es sind jeweils 3 Proben je Verdnnungsstufe anzusetzen. ANMERKUNG Sollen mehr als 2 ml Basissuspension untersucht werden, kann durch Membranfiltration ein greres Probevolumen geprft werden. Hierzu wird die Ba
36、sissuspension 30 min auf 75 C erhitzt und anschlieend die zu untersuchende Menge ber Membranfilter (Porengre 0,45 m) filtriert und das Filter mit Hilfe von sterilen Pinzetten aufgerollt. Die Filter werden in das Nhrmedium eingebracht und anschlieend mit 1 ml sterilisiertem Paraffin berschichtet. Die
37、 Membranfilter knnen steril bezogen oder mssen nach Vorschrift des Lieferanten sterilisiert werden. 8 Durchfhrung Die nach 7.3.4 vorbereiteten Reagenzglser werden 3 d bis 7 d bei 30 C im Anaerobiertopf bebrtet. Clostridien verursachen eine Schwarzfrbung des Nhrmediums. Die Reagenzglser werden nach 3
38、 d Bebrtung dem Brutschrank entnommen und kontrolliert. Falls noch keine Verfrbung festzustellen ist, wird weitere 4 d bebrtet und dann ausgewertet. DIN 54383:2015-11 8 9 Angabe der Ergebnisse Die niedrigste Verdnnungsstufe, bei der eine Verfrbung des Nhrmediums nach Abschnitt 8 in mindestens zwei d
39、er drei parallelen Anstze auftritt, wird angegeben und die entsprechende Packstoffmasse in g berechnet. BEISPIEL Trockengehalt der Probe = 94,5 % Einwaage: 1,058 2 g lufttrockene Pappe 1,000 g ofentrockener Pappe/100 ml Peptonlsung (Basissuspension) Auswertung: Nach 3 d Bebrtung Verfrbung bei 0,5 ml
40、 Basissuspension = 0,005 g ofentrockener Pappe Ergebnis:. In 0,5 ml Basissuspension 0,005 g ofentrockener Pappe sind nach 3 d Bebrtung Clostridiensporen nachweisbar 10 Prfbericht Der Prfbericht muss folgende Angaben enthalten: a) Verweisung auf diese Norm, d. h. DIN 54383; b) Art und Bezeichnung des
41、 geprften Materials; c) Ort, Datum und Zeit der Probenahme; d) Trockengehalt der Probe nach DIN EN ISO 638; e) Packstoffmasse in g ofentrockenen Materials, in der noch Clostridiensporen nachzuweisen sind; f) Bebrtungszeit; g) gegebenenfalls Abweichungen von dieser Norm; h) Name des Prfers; i) Ort und Datum der Prfung. DIN 54383:2015-11 9 Literaturhinweise DIN 12331, Laborgerte aus Glas Becher DIN 12605, Laborgerte aus Glas Wgeglser DIN EN ISO 648, Laborgerte aus Glas Vollpipetten
