1、第35讲 克隆技术,知识1 克隆的概念与植物克隆,知识2 动物的克隆,知识梳理,考点一 植物的克隆,考点二 动物的克隆,考点突破,知识1 克隆的概念与植物克隆 一、克隆技术,教材研读,1.克隆的概念 不通过两个分子、两个细胞或两个个体的结合,只由一个 模板分子 、 母细胞 或母体直接形成新一代分子、细胞或个体。,2.不同水平上的克隆 (1)分子水平:基因克隆是指某种 目的基因 的复制、分离过程。 (2)细胞水平:细胞克隆技术在利用杂交瘤制备单克隆抗体的操作中得 到充分运用。 (3)个体水平:包括植物的 无性生殖 及 核移植 技术。,3.克隆技术的发展方向 微生物克隆、 遗传工程 克隆、个体水平
2、上的克隆。,4.克隆的条件 (1)具有包含物种完整基因组的 细胞核 的活细胞。 (2)能有效调控细胞核发育的 细胞质 物质。 (3)完成胚胎发育的必要的 环境条件 。,二、植物的克隆 1.原理 植物细胞的全能性,即植物体的每个生活细胞都具有 遗传上的全能 性 ,因而都具有发育为完整植株的潜能。,2.植物组织培养程序配制培养基 切取 消毒 的组织块培养 获得愈伤组织 诱导新植株,3.原生质体培养 离体植物细胞 原生质体 新植株,4.液体悬浮培养 将含有 愈伤组织 的试管 摇床 单细胞。 这种单细胞细胞质丰富、 液泡小 而细胞核大,这是胚性细胞的特 征。在适宜的培养基中,这种单细胞可以发育成 胚状
3、体 ,然后继 续发育,可以形成植株。,5.植物细胞工程 外源遗传物质 受体细胞 具有特定性状的新植株或通过 细胞融合、显微注射等将不同来源的遗传物质重新组合以获得具有特 定性状的新植株,6.植物细胞全能性的表达程度 实践证明,植物体的几乎所有组织的细胞,通过诱导都可以再生新植株, 都具有遗传上的 全能性 。但是由于不同种类植物或同种植物的 不同基因型个体之间遗传性的差异,细胞全能性的表达程度 大不 相同 。有些品种或品系的培养细胞所诱导出的再生植株,在多次 继代培养 后,会丧失细胞全能性的表达能力。,知识2 动物的克隆 一、动物细胞培养 从动物体中取出相关的组织,将其分散成 单个的细胞 ,然后
4、在人 工控制的培养条件下,使这些细胞得以生存,并保持 生长、分裂(繁 殖)乃至接触抑制 和 有规律的衰老、死亡 等生命活动现象。 二、动物组织培养 动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性。动物组织培 养过程中可以伴随 组织分化 。,三、原代培养和传代培养 1.原代培养:从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。 2.传代培养:将 原代培养 的细胞分成若干份,接种到若干份培养基 中,使其继续生长、增殖。,四、细胞系和细胞株 1.细胞系:原代培养物在 首次传代 时就成为细胞系。 2.细胞株:从 原代培养物或细胞系 中获得的具有特殊性质的细胞, 一般具有恒定的染色体组型、 同功酶类型 、病毒敏
5、感性和 生化特性 等。,五、克隆培养法 1.概念:把一个单细胞从群体中分离出来单独培养,使之繁衍成一个 新的细胞群体 的技术。未经克隆化的细胞系具有 异质性 。 2.基本要求:必须肯定所建成的克隆来源于 单个细胞 。,六、动物细胞融合技术及应用 1.原理: 细胞膜的流动性 。 2.方法:物理法(电激)、化学法和 生物法(灭活病毒) 。 3.单克隆抗体的特点: 特异性强,灵敏度高,并可大量制备 。,1.一般来说,动物细胞体外培养需要满足以下条件 ( D ) 无毒的环境 无菌的环境 合成培养基需加血清 温度与动物体温相近 需要O2,不需要CO2 CO2能调节培养液pH A. B. C. D.,解析
6、 动物细胞培养需要满足以下条件:无菌、无毒的环境,在培养 液中可以添加一定量的抗生素,以防止培养过程中的污染;细胞体外培 养需要的营养物质与体内基本相同,需要糖、氨基酸、促生长因子、无 机盐、微量元素等;在使用合成培养基时,通常需要加入血清、血浆等 一些天然成分;细胞体外培养的适宜温度一般与动物的体温相近;多数 细胞生存的适宜pH为7.27.4;细胞培养需要的气体主要有O2和CO2,O2 是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的pH。,2.如图表示植物组织培养过程。据图分析下列叙述正确的是 ( D )A.植株根尖细胞的全能性比植株根尖细胞的强 B.试管的培养基中含有植物生长调节剂,不
7、含有机物 C.试管中的细胞具有细胞质丰富、细胞核和液泡都大的特性 D.调节培养基中植物生长调节剂的比例可诱导产生不同的植物器官,解析 由于是由上的组织经培养形成的个体,故二者根尖细胞 的全能性应该相同,A错;由到的过程中植物细胞不能进行光合作 用,因而试管的培养基中含有有机物如蔗糖等,故B错;试管中的细 胞为愈伤组织细胞,液泡小,故C错。,3.下列关于“筛选”的叙述中,不正确的是 ( C ) A.在诱变育种、杂交育种、单倍体育种过程中都要进行筛选 B.在制备单克隆抗体、通过植物体细胞杂交的方法获得杂种植株的过 程中要进行筛选 C.在小鼠胚胎细胞培养过程中,通过筛选可以获得具有无限分裂能力的 细
8、胞系 D.将目的基因导入受体细胞后需要进行筛选,解析 诱变育种、单倍体育种和杂交育种会产生多种不同性状的 子代,要得到特定性状的品种必须进行筛选;两种植物的原生质体融合 时有三种不同的融合原生质体(在只考虑两两融合的情况下),最终需要 的是两种不同植物的原生质体的融合,所以必须进行筛选;将目的基因 导入受体细胞后需要进行筛选,选出导入成功的受体细胞;动物细胞培 养中能无限分裂的细胞在培养基中保留,其他细胞衰亡,不需筛选。,4.回答下列关于动物的克隆问题: (1)基因型不同的细胞间的细胞融合称为 技术,人鼠细 胞融合通常会丢失 的染色体,因此可利用这个特点,进行人类基 因的定位。 (2)科学家将
9、 生成细胞和瘤细胞进行杂交,形成杂交瘤细胞,对一 种克隆的杂交瘤细胞进行传代培养,形成分泌单抗的 ,就能长久地得到单一的单抗,单抗比一般抗血清的抗体优越得多的 原因是 。,(3)科学家从一个流产的雌性猕猴的胚胎中,取两个体细胞的核,并分别 进行核移植,发育成双胞胎克隆猴,该双胞胎克隆猴相当于是 (同卵/异卵)双生。克隆动物的成功说明了在胚胎发育和个体发育中,细 胞质具有调控 发育的作用。,答案 (1)细胞杂交 人 (2)抗体 细胞株 单抗识别抗原部位专一, 而一般抗血清的抗体是一群识别不同抗原部位的抗体混合物 (3)同卵 细胞核,解析 (1)基因型不同的细胞间的细胞融合就是细胞杂交;人鼠细胞
10、融合通常会丢失人的染色体,可以进行人类基因的定位。(2)科学家将 抗体生成细胞和瘤细胞进行杂交,形成杂交瘤细胞;对一种克隆的杂交 瘤细胞进行传代培养,形成单抗细胞株,就能长久地得到单一的单抗,单 抗比一般抗血清的抗体优越得多的原因是单抗识别抗原部位专一,而一 般抗血清的抗体是一群识别不同抗原部位的抗体混合物。(3)用于核移 植的两个细胞核都来自同一个流产的胚胎,即来自同一个受精卵有丝分 裂产生的子细胞,所以该双胞胎克隆猴相当于同卵双生;克隆动物的成功 说明了在胚胎发育和个体发育中,细胞质具有调控细胞核发育的作用。,考点一 植物的克隆,一、植物细胞的全能性,考点突破,1.基本含义:植物体的每个活
11、细胞都具有遗传上的全能性,因而都具有发 育成完整植株的潜能。 2.基础:植物体的每一个细胞都含有该物种发育所需的全部遗传信息。,3.全能性表达的条件: (1)离体、无菌。 (2)一定的营养物质,如水、无机盐、蔗糖、维生素等。 (3)植物生长调节剂。,4.在生物体内细胞并没有表现出全能性的原因 基因在特定的时间和空间条件下选择性表达,细胞分化为不同的组织、 器官。 5.植物细胞全能性的大小: 受精卵生殖细胞体细胞 分化程度低的细胞分化程度高的细胞,二、植物组织培养和植物细胞工程 1.植物组织培养的步骤,2.植物细胞工程的操作过程,3.植物组织培养基本操作要求 (1)取材:含形成层(分生组织)的部
12、分易于诱导形成愈伤组织。尽管植物 体其他已分化的部分也可以用于组织培养,但诱导愈伤组织的形成比较 困难。 (2)消毒:培养基中含有丰富的营养物质,不仅有利于培养物的生长,也利 于各种杂菌的生长。一旦污染,迅速生长的各种杂菌不仅会与培养物争 夺营养,还会产生大量对培养物有害的物质,导致培养物死亡。知能拓展 (1)植物激素是影响脱分化、再分化的重要因素。当细胞,分裂素与生长素共同使用时,能强力地促进愈伤组织的形成,两者不同 浓度的配比在再分化过程中,分别对诱导根或芽的产生起关键作用。当 细胞分裂素与生长素的浓度比高时,有利于芽的产生;浓度比低时,有利 于根的产生。 (2)光照:对于植物组织培养来说
13、,光照条件非常重要,包括光照强度、时 间和波长。但在愈伤组织的诱导阶段往往要暗培养,而在分化再生的过 程中一定要有光照。愈伤组织诱导阶段的暗培养有利于细胞的脱分化 产生愈伤组织,如果在光照条件下,容易分化产生维管等组织,则不利于,产生大量的愈伤组织。 (3)无菌:如果在培养基上有细菌等微生物存在,它们比植物细胞具有更 强的新陈代谢能力,比植物细胞生长繁殖得更快,而且它们会产生毒素, 使培养基上的植物细胞死亡。因此,在培养过程中要求一系列的消毒、 灭菌,并且要求无菌操作。,典例1 如图表示通过克隆技术获得烟草植株的过程,请回答:(1)过程往往选取烟草叶片的幼嫩部位需经过 处理,才能置于 培养基中
14、进行培养。,(2)过程称为 ,过程称为 。 (3)通过悬浮培养形成的单细胞可发育成 ,继而形成植物幼体;也 可利用 水解细胞壁,获得 ,培养后也可 形成植株。 (4)在培养过程中,若要诱导芽的产生,则配制植物激素时要 。 A.添加适量的生长素和适当减除其他某些激素 B.适当配比的生长素和细胞分裂素 C.添加适量的生长素和适当增加其他某些激素,D.适当增加细胞分裂素和生长素的量 (5)烟草细胞很容易再生出新植株,但在长期培养过程中,其胚胎发生和 器官形成能力下降,不可能的原因是 。 A.染色体畸变或细胞核变异 B.组织或细胞中的激素平衡被打破 C.产生了缺乏成胚性的细胞系 D.植物细胞全能性丧失
15、,解题关键 解答本题的关键在于熟悉植物组织培养的条件、过程和 各时期的特点,以及了解植物克隆的不同方法,如原生质体培养和液体 悬浮培养。,答案 (1)消毒 (2)脱分化 再分化 (3)幼胚(胚状体) 纤维素酶和果 胶酶 原生质体 (4)B (5)D,解析 (1)植物组织培养过程中如果在培养基上有细菌等微生物存在, 它们比植物细胞具有更强的新陈代谢能力,比植物细胞生长繁殖得更 快,而且它们会产生毒素,使培养基上的植物细胞死亡。因此,在培养过 程中要求一系列的消毒、灭菌,并且要求无菌操作。(2)植物组织培养 的原理是植物体细胞具有全能性。培养过程可概括为离体的植物器 官、组织或细胞脱分化形成愈伤组
16、织,然后再分化为根、芽或胚状体, 最后发育为完整植株。(3)液体悬浮培养形成的单细胞如果在适宜的培 养基中可以发育成胚状体,最后形成植株;植物细胞壁的主要成分是纤,维素和果胶,可以用纤维素酶和果胶酶处理获得裸露的原生质体,进行 原生质体培养,也可以获得植株。(4)适量的生长素和细胞分裂素配比 可以诱导芽的产生。(5)在长期的培养过程中,培养物的胚胎发生和器 官形成能力下降的可能原因是染色体畸变、细胞核变异或者非整倍体 的产生;细胞或者组织中的激素平衡被打破,或细胞对外源生长物质的 敏感性改变;或者由于其他原因产生了缺乏胚性的细胞系。,1-1 我国植物学家将名贵兰花的茎尖细胞放在培养基中进行培养
17、,最 终发育成完整的新植株。如图是细胞培养形成兰花植株示意图,请据图 分析回答: 兰花植株 茎尖的切片试管植物 从切片中分离出的茎尖细胞胚状体 愈伤组织,(1)过程和分别表示 和 。 (2)在培养过程中,除了提供水分、无机盐、糖类、维生素及氨基酸外, 还需要在培养基中加入 。同时,在培养过程 中,除必需的温度、光照和氧气等外界条件外,成功的另一个关键是操 作过程必须保证 。 (3)从育种的角度看,植物组织培养与有性生殖相比,优势主要有(列举2 条): 。,(4)在植物组织培养的过程中,可以对 进行化学或物理的诱变 处理,促使其发生突变,再通过诱导分化形成植株,从中选育出优良品 种。这种作物新品
18、种的培育方法属于 。 (5)若将兰花的茎尖细胞换成兰花的花粉粒,经组织培养和秋水仙素处 理形成植株,这种育种方法称为 ,其优点是 。,答案 (1)脱分化 再分化 (2)植物激素(或植物激素类似物) 无菌 (3)能保持亲本的优良性状;培养周期短,繁殖效率高;能培育无病毒植株 (任举2条即可) (4)愈伤组织 突变体的利用 (5)单倍体育种 缩短 育种年限,培育的品种一定是纯种,解析 该题主要考查了植物组织培养的过程、单倍体育种和突变体的 利用。(1)过程为脱分化,过程为再分化,其中在过程中既有细胞 分裂,又有细胞分化。(2)在植物组织培养过程中,不论是脱分化还是再 分化,都需要植物激素刺激,并且
19、要求无菌操作。(3)植物组织培养与有 性生殖相比具有能保持亲本的优良品质,培养周期短,繁殖效率高,能培 育无病毒植株等优点。(4)突变体利用的操作对象是愈伤组织,但是该 种方法具有很大的盲目性。(5)单倍体育种的优点表现在缩短育种年 限、后代不发生性状分离等。,考点二 动物的克隆一、动物的克隆,1.动物细胞培养 (1)过程(2)原理:细胞增殖。,(3)条件 充足的营养供给微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因 子、血清等。 适宜的温度:36.5 0.5 ;适宜的pH:7.27.4。 气体环境 无菌、无毒环境,(4)应用 生产病毒疫苗、单克隆抗体、干扰素等。 利用动物细胞培养技术中的细胞贴壁生
20、长和接触抑制的特点,可用烧 伤病人自己的健康皮肤细胞培养出大量的自身薄层皮肤细胞,以供植皮 所需。 培养的动物细胞用于检测有毒物质,判断某种物质的毒性。 用于生理、病理、药理等方面的研究。,知能拓展 动物细胞培养中的取材很重要,大部分取自动物胚胎或 出生不久的幼龄动物的器官或组织,这是因为这些组织或器官的细胞生 命力旺盛,分裂能力强。动物细胞培养中胰蛋白酶可消化组织中的胶 原纤维和细胞外的其他成分,获得细胞悬浮液。培养前要将组织细胞分 散成单个细胞的原因:成块组织不利于培养,其中的细胞不能与培养液 充分接触,而且动物细胞具有接触抑制的特性,分散成单个细胞有利于 培养。原代培养的细胞因代谢消耗和
21、接触抑制现象,培养到一定时期 必须进行传代培养。,2.原代培养和传代培养,3.细胞系和细胞株,4.克隆培养法 (1)概念:把一个单细胞从群体中分离出来单独培养,使之繁衍成一个新 的细胞群体的技术,又称细胞克隆。 (2)培养结果:细胞克隆的遗传性状均一,表现的性状相似,称为纯系。 (3)应用 分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。 研究遗传规律和生理特性的重要材料。,5.克隆与核移植 (1)原理:动物体细胞核具有全能性。 (2)过程:,(3)结果:产生新个体。,易混易错 动物难以克隆的根本原因:分化了的动物细胞的细胞质 中的调节蛋白,关闭了细胞核中与个体发育有关的基因。 重组卵发育成一个新个体,体现了
22、细胞核的全能性而非动物细胞的全 能性。 重建合子的细胞质必须来自卵细胞的原因:卵细胞的细胞质中没有与 关闭个体发育有关基因的调节蛋白。 动物克隆属于无性繁殖,产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲 本一致。,二、单克隆抗体的制备,1.原理:一个(或一种)浆细胞(效应B细胞、B淋巴细胞)只产生一种抗体, 小鼠骨髓瘤细胞能够无限增殖。因此杂交瘤细胞就具备了既能无限增 殖,又能大量产生单一抗体的特征。,2.用杂交瘤技术制备单抗的基本方法 (1)用外界抗原刺激动物(如小鼠、兔子等),使其发生免疫反应,使B淋巴 细胞产生抗体; (2)利用仙台病毒或聚乙二醇等作介导,使经免疫的动物的脾细胞与可 以无限传代
23、的骨髓瘤细胞融合; (3)经过筛选、克隆培养,获得来自单一细胞的既能产生特异抗体、又 能无限增殖的杂交瘤细胞克隆。,3.过程杂交瘤细胞 杂交瘤细胞单克隆抗体,4.用杂交瘤技术制备单抗的优点 可以从特异抗原成分比例极少的抗原混合物中获得单抗。这是因为,经 过克隆筛选,可以从产生各种不同抗体的杂交瘤混合群体中得到产生特 异抗体的杂交瘤。,5.单抗的应用 单抗可作为特异探针,研究相应抗原蛋白的结构、细胞学分布及其功 能。易错易混 (1)关键点分析: 细胞融合完成的标志:细胞核融合成一个核。 杂交瘤细胞的特性:既能无限增殖,又能产生大量特异抗体。 获取单克隆抗体的场所;若在培养基中进行杂交瘤细胞培养,
24、则从培 养液中提取;若在小鼠或其他动物腹腔中培养,则从腹水中提取。,(2)用杂交瘤技术制备单克隆抗体中的几种细胞比较,(3)制备单克隆抗体过程中的两次筛选,1.动物细胞培养和动物体细胞核移植的比较,易混易错 动物细胞培养中两次用到胰蛋白酶,第一次用胰蛋白酶 处理剪碎的组织使之分散成单个细胞,第二次使贴壁细胞从瓶壁上脱落 下来。 原代培养与传代培养的分界点为分瓶培养时。,2.植物组织培养和动物细胞培养的比较,典例2 (2016课标全国,40,15分)下图表示通过核移植等技术获得某 种克隆哺乳动物(二倍体)的流程。回答下列问题: (1)图中A表示正常细胞核,染色体数为2n,则其性染色体的组成可为,
25、。过程表示去除细胞核,该过程一般要在卵母细胞培养至适当 时期再进行,去核时常采用 的方法。代表的过程是 。 (2)经过多次传代后,供体细胞中 的稳定性会降低。因此,选材 时必须关注传代次数。 (3)若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同,从遗传物质的角度 分析其原因是 。 (4)与克隆羊“多莉(利)”培育成功一样,其他克隆动物的成功获得也证 明了 。,解题关键 理解动物个体克隆的过程以及用到的技术。,答案 (1)XX或XY 显微操作 胚胎移植 (2)遗传物质 (3)卵母细 胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响 (4)动物已分 化的体细胞的细胞核具有全能性,解析 (1)因供体的性别
26、不确定,故其细胞核内的性染色体组成为XX或 XY;一般将卵母细胞培养到M中期,用显微操作法将其细胞核去除; 代表的过程是胚胎移植。(2)传代培养10代以内的细胞可以保持正常的 二倍体核型,超过10代以后,供体细胞中遗传物质的稳定性会降低。(3) 克隆动物细胞质中的遗传物质来自卵母细胞的细胞质,细胞质中的遗传 物质对克隆动物的性状会产生影响。(4)克隆动物的成功获得可以证明 动物已分化的体细胞的细胞核具有全能性。,2-1 科学家利用植物体细胞杂交技术成功获得了番茄马铃薯杂种 植株,为了便于杂种细胞的筛选和鉴定,科学家利用红色荧光和绿色荧 光分别标记番茄和马铃薯的原生质体膜上的蛋白质,其培育过程如
27、图所 示:(1)植物体细胞杂交依据的生物学原理有,。 (2)人工诱导原生质体融合的方法有物理法和化学法,其中物理法包括 等。在鉴定杂种原生质体时可用显微镜观察,根 据细胞膜表面荧光的不同可观察到 种不同的融合原生质体(只 考虑两两融合),当观察到 时可判断该原生质体是由番茄原生质体和马铃薯原生质体融合而成 的。 (3)过程和过程依次为 ,过程中的培养基常添,加的植物激素是 。 (4)若番茄细胞内有m条染色体,马铃薯细胞中含n条染色体,则“番茄 马铃薯”细胞在有丝分裂后期含 条染色体。,答案 (1)细胞膜的流动性、植物细胞的全能性 (2)离心、振动、电 激 3 融合的原生质体表面既有红色荧光又有
28、绿色荧光 (3)脱分 化、再分化 生长素和细胞分裂素 (4)2(m+n),解析 (1)植物体细胞杂交是指将不同种的植物体细胞,在一定条件下 诱导融合成杂种细胞,并把杂种细胞培育成杂种植株的技术,因此体现 的生物学原理为细胞膜的流动性、植物细胞的全能性。(2)人工诱导原 生质体融合的物理法包括离心、振动、电激等。科学家利用红色荧光 和绿色荧光分别标记番茄和马铃薯的原生质体膜上的蛋白质,因此在鉴 定杂种原生质体时可用显微镜观察。细胞膜表面发出不同荧光的融合 原生质体有3种情况(只考虑两两融合):发红色荧光的番茄原生质体融 合的原生质体、发绿色荧光的马铃薯原生质体融合的原生质体、既有,红色荧光又有绿色荧光的番茄原生质体和马铃薯原生质体融合而成的 原生质体,所以当观察到融合的原生质体表面既有红色荧光又有绿色荧 光时可判断该原生质体是由番茄原生质体和马铃薯原生质体融合而成 的。 (3)植物组织培养过程中杂种细胞通过脱分化形成愈伤组织,愈伤 组织通过再分化形成植物体,所以过程和过程依次为脱分化、再分 化。在植物组织培养过程中,其培养基常添加的植物激素是生长素和细 胞分裂素。(4)杂种细胞的染色体数为融合前两种细胞染色体数之和, 即(m+n)条;细胞在有丝分裂后期,着丝粒分裂,姐妹染色单体分开,导致 杂种细胞中的染色体数目加倍为2(m+n)条。,
