1、1.2.1 目的基因的获取和基因表达载体的构建,专题1 1.2 基因工程的基本操作程序,学习目标 1.说出基因工程的基本操作程序。 2.理解获取目的基因的途径。 3.说出基因表达载体的构建的目的与组成。,方式一 抑制疾病传播的转基因蚊子 巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，巴西科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具该基因的转基因雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而减少了该种蚊子的数量，达到抑制疾病传播的目的
2、。怎样才能最终得到转基因雄蚊呢？让我们一起来学习基因工程的基本操作程序吧！,方式二 师：出示我国有知识产权的转基因抗虫棉的培育图解：,问：转基因抗虫棉的培育需要哪些步骤？ 学生看图并回答：首先要获得目的基因，其次将目的基因连接到Ti质粒上，然后将重组的Ti质粒导入受体细胞，最后要重建转基因植物。 根据学生回答补充：还需检测抗虫基因是否已经进入棉花植株，并由此引出基因工程的四部曲。,新知导学,达标检测,内容索引,新知导学,1.基因工程的基本操作程序 (1) 的获取。 (2) 的构建。 (3)将目的基因导入 。 (4)目的基因的 。 2.目的基因的获取 (1)目的基因：主要是指 的基因，也可以是一
3、些具有_的因子。,一、目的基因的获取,目的基因,基因表达载体,受体细胞,检测与鉴定,编码蛋白质,调控作用,(2)常见方法 从基因文库中获取 a.基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入_ _中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。,受体菌的群,体,b.种类,基因组文库：包含一种生物 基因 部分基因文库：包含一种生物的 基因,所有的,一部分,c.提取依据： 、基因的功能、 、基因的转录产物mRNA，以及 等特性。,基因的核苷酸序列,基因在染色体上的位置,基因的表达产物蛋白质,利用PCR技术扩增目的基因 a.PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸
4、合成技术。 b.目的：短时间内大量扩增目的基因。 c.原理： 。 d.前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。 e.过程 第一步：加热至9095 ， ； 第二步：冷却至 ，引物结合到互补DNA链；,DNA双链复制,DNA解链为单链,5560,第三步：加热至7075 ，热稳定 (Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。 如此重复循环多次。 f.结果：每一次循环后，目的基因的量可以 ，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。 化学方法直接人工合成 a.条件：基因比较小， 又已知。 b.方法：借助 用化学方法直接人工合成。,DNA聚合酶,增加一倍,核苷酸序列,DNA合成仪,1.PCR技术与细胞
5、内DNA复制的比较,归纳总结,2.获取目的基因的方法比较,3.获取目的基因的方法选择 (1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。 (2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学方法直接人工合成。 (3)如果知道要扩增的目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，可以通过PCR技术扩增目的基因。,例1 以下为形成cDNA(图中的单链DNA)过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是,A.催化过程的酶是RNA聚合酶 B.过程发生的变化是引物与单链DNA结合 C.催化过
6、程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温 D.如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%,答案,解析,解析 由题意可知，分别表示反转录、DNA的复制、DNA解链、引物结合到互补DNA链及互补链的合成，B正确； 过程由反转录酶催化完成，A错误； 催化过程的酶都是DNA聚合酶，过程是在7075 的高温条件下进行的，只有该过程中的酶需耐高温，C错误； 在DNA分子中有碱基T无U，D错误。,例2 (2017湖南长沙一中期末考试)下列有关获取目的基因的方法，叙述错误的是 A.从基因文库中直接获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定
7、的盲目性 B.由于真核细胞的基因中含有不表达的DNA片段，所以一般使用人工合成的方法获取真核细胞中的目的基因 C.如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以利用化学方法直接人工合成 D.PCR技术的原理是DNA复制，需DNA连接酶催化DNA合成,答案,解析,解析 PCR技术的原理是DNA分子的复制，需要耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成，D错误。,1.基因表达载体构建的目的 使目的基因在受体细胞中 ，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够 和 。 2.基因表达载体的组成,二、基因表达载体的构建,稳定存在,表达,发挥作用,启动子,首端,RNA聚合酶,转录,终止子,尾端,RNA聚合酶,转录,标记,目的基
8、因,3.基因表达载体的构建过程 一般用同一种 酶分别切割载体和目的基因，再用 酶把两者连接(如图)。,DNA连接,限制,1.启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别,归纳总结,2.构建基因表达载体时限制酶的选择原因分析 (1)选用同一种限制酶切割目的基因和载体的原因：选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。 (2)基因工程操作时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体的原因：如果用一种限制酶切割，目的基因两侧的末端以及质粒切口的两个末端都是互补的，因此连接时可能会出现载体与载体、目的基因与目的基因、目的基因与载体三种连接情况
9、，而符合要求的只有载体与目的基因的连接。如果用两种不同的限制酶进行切割就可以有效避免载体与载体以及目的基因与目的基因的连接，提高连接的有效性。,例3 (2017河南南阳一中月考)在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要 DNA连接酶 限制性核酸内切酶 RNA聚合酶 具有标记基因的质粒 目的基因 四种脱氧核苷酸 A. B. C. D.,答案,解析,解析 构建重组质粒时，首先要用限制性核酸内切酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，其次需要用DNA连接酶将目的基因与载体连接；RNA聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要RNA聚合酶；获得重组质粒时，需要具有标记基因的质粒作为载体；重组质粒是由目的
10、基因与质粒形成的；四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。,A.图示过程是基因工程的核心步骤 B.表达载体构建时需要用到限制酶Sma C.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构,例4 如图是利用基因工程技术培育转基因植物生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst、Sma、EcoR、Apa为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是,答案,解析,解析 图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤；构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶Pst、EcoR；抗卡那霉素基因是标
11、记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。,学习小结,基因工程的基本操作程序,目的基因 的获取,目的基因,基因文库,文库文库(cDNA文库),方法,从 中获取 PCR技术扩增 _,基因表达载体的构建,目的 组成 构建过程,将目的基因导入受体细胞 目的基因的_,检测与鉴定,基因组,部分基因,基因文库,人工合成,达标检测,1.基因工程的核心是 A.目的基因的获取 B.基因表达载体的构建 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测与鉴定,1,2,3,4,5,答案,解析 目的基因构建表达载体后才能使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗
12、传给下一代，同时，使目的基因能发挥作用，只有构建表达载体后，才能根据载体上的标记基因鉴别目的基因是否导入了受体细胞，从而筛选出含目的基因的受体细胞，避免进行盲目的无效工作。,解析,2.如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是,A.三种方法都需要酶并均在体外进行 B.碱基对的排列顺序均相同 C.三种方法均属于人工合成法 D.方法a不遵循中心法则,答案,解析,1,2,3,4,5,解析 这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要反转录酶和DNA聚合酶；方法b需要限制酶；方法c需要DNA聚合酶)，A正确； 通过方法a得到的目的基因不含有内含子，通过方法c得到的目的
13、基因的碱基序列可能有多种，因此碱基对的排列顺序不都相同，B错误； 方法a和c属于人工合成法，而方法b是从供体细胞的DNA中直接分离目的基因的方法，C错误； 方法a遵循中心法则，D错误。,1,2,3,4,5,1,2,3,4,5,3.如图为基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是,答案,A.氨苄青霉素抗性基因 B.启动子 C.限制酶 D.DNA连接酶,解析 启动子是该表达载体所必需的，功能是启动插入基因的转录过程。,解析,1,2,3,4,5,4.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是 A.切割含抗虫基因的DNA片段和载体必须用同一种限制酶 B.抗虫基因表达载体中要有启动子和
14、终止密码子 C.抗虫基因表达载体必须具备标记基因，其作用是筛选含有目的基因的受体细胞 D.抗虫基因的表达启动于复制原点,答案,解析,解析 切割含抗虫基因的DNA片段和载体可以用不同的限制酶，只要切割出的末端相同即可，A项错误； 抗虫基因表达载体的构建必须具备启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上，B项错误； 基因表达载体必须具备标记基因，其作用是检测目的基因是否导入到受体细胞中，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来，C项正确； 抗虫基因的表达开始于启动子，D项错误。,1,2,3,4,5,1,2,3,4,5,5.重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次
15、PCR扩增，从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。如图是利用重叠延伸PCR技术扩,增某目的基因的过程。其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中引物2、引物3)分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得目的基因。结合所学知识，回答下列问题：,(1)引物中GC的含量影响着引物与模板DNA结合的稳定性，引物中GC的含量越高，结合稳定性_。,越高,解析 由于C与G之间有3个氢键，而A与T之间有2个氢键，所以引物中C与G含量越高，引物与模板DNA的结合就越稳定。,答案,解析
16、,1,2,3,4,5,(2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_ _。,引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用,解析 由题干可知，引物2和引物3具 有互补配对片段，如果将引物2和引物3放在一个反应系统中，则会引起引物2和引物3的结合而失效。,答案,解析,1,2,3,4,5,(3)在引物1、引物2组成的反应系统中，经第一阶段形成图示双链DNA至少要经过_次复制。,2,解析 第一阶段形成的2个DNA分子分别含有引物1和引物2，图中第一阶段形成的DNA分子同时具有引物1和引物2，图示双链DNA分子至
17、少要经过2次复制才能形成。,答案,解析,1,2,3,4,5,(4)若在引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均复制一次，共产生_种双链DNA分子。,3,解析 两个反应系统中各自形成2种DNA分子，但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA属于同一种DNA，故共形成3种DNA分子。,答案,解析,1,2,3,4,5,(5)若利用微生物扩增该目的基因，其基本步骤包括：_、_、微生物的筛选和培养、从菌群中获取目的基因。,目的基因与载体结合,将重组DNA导入受体细胞,解析 利用微生物扩增该目的基因的基本步骤为：将目的基因与载体结合；将目的基因导入受体细胞；微生物的筛选和培养，从菌群中获取目的基因。,答案,解析,1,2,3,4,5,
