1、第2节 微生物的纯培养,1.阐明接种方法。 2.进行微生物的分离和培养。,一,二,一、纯培养 人们要研究某种微生物的特性,就要从混杂的样品中取得所需的纯种,或者把受污染的菌种重新分离出来,使该微生物处于纯培养状态。也就是说,培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株,它们有着共同的来源,是同一细胞的后代。,一,二,二、微生物的分离与纯化 1.基本思路 一般根据微生物对营养物质、pH、氧气等条件的要求不同,供给它们适宜的生活条件,或加入某种抑制剂,造成只利于要分离的微生物生长、不利于其他微生物生长的环境,从而淘汰不需要的微生物,分离得到需要的微生物纯种。 2.原理 将待检测微生物样品通过划线或涂布
2、接种在固体培养基上,样品中的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单个菌落。将单个菌落接种到斜面培养基上,经培养后,即可得到一个微生物的纯种。 3.分离步骤 微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤。,一,二,4.接种方法 划线或涂布过程包括平板划线分离法和涂布分离法。常用的划线方法有平行划线和连续划线两种。,1.平板划线分离法的操作要点 (1)在操作第一步、每次划线之前及划线操作结束时都要灼烧接种环。操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物;每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种,使下一次划线时,接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端,
3、从而通过划线次数的增加,使每次划线时菌种的数目逐渐减少,以便得到单个菌落;划线结束后灼烧接种环能及时杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境或感染操作者。 (2)在灼烧接种环之后,要等其冷却后再进行划线,以免接种环温度太高,杀死菌种。 (3)在进行第二次以及其后的划线操作时,要从上一次划线的末端开始划线。划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.涂布分离法的操作要点 (1)稀释操作时,注意每次都要使菌液与水充分混匀。操作时,试管口和移液管应在距离火焰12 cm处。 (2)涂布平板
4、时的所有操作都应在火焰附近进行,同时酒精灯与培养皿的距离要合适,吸管头不要接触任何其他物体等。 (3)涂布时可转动培养皿,使涂布均匀。 (4)无菌玻璃涂棒末端浸在盛有体积分数为70%酒精的烧杯中,取出时,要让多余的酒精在烧杯中滴尽,然后将沾有少量酒精的玻璃涂棒在酒精灯火焰上引燃以灭菌,同时要注意防火。 平板划线分离法与涂布分离法各有优点,二者的目的都是分离得到单个菌落。平板划线分离法方法简单,涂布分离法单菌落更易分开,但操作复杂些。,3.对分离纯化效果的判断方法 (1)培养时,要将接种后的培养基和一个未接种的培养基一同培养。未接种的培养基的作用是对照,若其表面有菌落形成,说明培养基灭菌不彻底,
5、需要重新进行实验。 (2)如果对照培养基上无菌落形成,可观察接种后的培养基。如果培养基上大肠杆菌菌落呈白色,为圆形,光滑且有光泽,边缘整齐,则说明接种成功;如果出现了其他颜色、形状的菌落,说明有杂菌,需要重新进行分离纯化。 规律总结培养时间不同,菌落大小会不同,因为时间越长,菌落中细菌繁殖越多,菌落体积越大;培养时间越长,菌落数可能会增多,但已有的菌落分布位置应相同。,题型一,题型二,接种操作的注意事项 【例题1】 下列有关平板划线操作的叙述,不正确的是 ( ) A.第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 B.每次划线前,灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上的菌种
6、C.在第二区域内划线时,接种环上的菌种直接来源于菌液 D.划线结束后,灼烧接种环,能及时杀死接种环上的菌种,避免细菌污染环境或感染操作者 解析:在第二区域内划线时,接种环上的菌种来源于第一次划线的末端。 答案:C,题型一,题型二,对特定微生物的分离纯化 【例题2】 有些细菌可分解原油,从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。请回答下列问题。 (1)在筛选过程中,应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上,从功能上讲,该培养基属于 培养基。 (2)纯化菌种时,为了得到单菌落,常采用的接种方法有两种,即 和 。 (3)为了筛选出高效菌株,
7、可比较单菌落周围分解圈的大小,分解圈大说明该菌株的降解能力 。,题型一,题型二,(4)通常情况下,在微生物培养过程中,实验室常用的灭菌方法有火焰灭菌、 和 。无菌技术要求实验操作应在酒精灯 附近进行,以避免周围环境中微生物的污染。,题型一,题型二,解析:(1)要获得分解原油的细菌,应选择以原油为唯一碳源的培养基,以保证这种细菌可以大量繁殖,而其他细菌不能生存。此种培养基属于选择培养基。(2)纯化菌种常用平板划线分离法和涂布分离法。(3)在以原油为唯一碳源的培养基上,菌落周围的原油被分解而形成分解圈,分解圈越大,说明该菌株降解能力越强。(4)实验室灭菌的方法有火焰灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌法,
8、实验操作要在酒精灯火焰附近的无菌区进行。 答案:(1)原油 选择 (2)平板划线分离法 涂布分离法 (3)强 (4)干热灭菌 高压蒸汽灭菌法 火焰,1,2,3,1.涂布分离法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是( ) A.操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释 B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面 C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落 D.操作过程中,培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理 答案:C 解析:涂布分离法是将菌液进行一系列的浓度梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面,在适宜条件下培养。只有用稀释度足够高的菌液涂布,聚集
9、在一起的微生物才能在固体培养基表面分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落。,1,2,3,2.为了获得纯度高的大肠杆菌,需要对大肠杆菌进行培养和分离。培养大肠杆菌一般用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 (1)培养大肠杆菌时,配制固体培养基的基本流程是称量_ 加塞和包扎 摆斜面及倒平板。 (2)称量时,由于牛肉膏比较黏稠,可以用玻璃棒挑取,放在称量纸上称量。由于牛肉膏和蛋白胨 ,称量时动作要迅速,称后要及时盖上瓶盖。 (3)在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上大肠杆菌能生长,说明培养基含有 等大肠杆菌生长所需的营养要素。 (4)微生物纯化培养可以通过多种接种方法,如 和 等,使大肠杆菌在固体培养基上形成单
10、个 ,从而获得纯菌株。,1,2,3,答案:(1)溶化 调pH 分装 灭菌 (2)容易吸潮 (3)碳源、氮源、无机盐、水 (4)平板划线分离法 涂布分离法 菌落,1,2,3,3.分析下表所示培养基的配方,回答下面的问题。,1,2,3,(1)在该培养基的配方中,为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是 和 。 (2)按物理状态划分该培养基属于 培养基,理由是培养基中含有 。 (3)由于培养基中只有尿素一种 源,所以该培养基只能用于能够合成脲酶(可催化尿素分解)的微生物的培养。将土壤浸出液涂布在此培养基平板上能够从土壤中筛选出 的细菌。 (4)在微生物学中,将允许特定种类的微生物生长,并能抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基,称作 培养基。,1,2,3,答案:(1)葡萄糖 尿素 (2)固体 琼脂(凝固剂) (3)氮 分解尿素 (4)选择 解析:(1)碳源是为微生物的生长提供碳元素的物质,氮源是提供氮元素的物质,所以该培养基的碳源是葡萄糖,氮源是尿素。(2)根据物理状态可以将培养基分为固体培养基和液体培养基,固体培养基中添加了琼脂做凝固剂。(3)(4)绝大多数生物都能利用葡萄糖,但是,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,所以此培养基对微生物有选择作用,选择对象是能够利用尿素的微生物。,
