1、1现代生物科技专题理清知识联系记清主干术语1基因工程操作中用到的基本工具有限制性核酸内切酶、DNA 连接酶和载体。 2限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割。3质粒是常用的载体，它是一种小型的环状 DNA 分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。4基因工程的基本操作程序：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定。5基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。6目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，导入动物细胞常用显微注射法，导入微生物细胞常用感受态细胞法。7检测转基因生物的 DNA 上是否插入了目
2、的基因常用 DNA 分子杂交技术，检测目的基因是否进行了转录同样是采用分子杂交技术，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原抗体杂交技术。8蛋白质工程的操作过程：从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)基因表达产生需要的蛋白质。9植物组织培养的基本过程：外植体 愈伤组织 根、芽植物体。 脱 分 化 再 分 化 10植物体细胞杂交需要用酶解法制备原生质体，所用的酶包括纤维素酶和果胶酶。11人工诱导原生质体融合的方法分为物理法和化学法，物理法包括离心、振动、电2激等，化学法一般用聚乙二醇作为诱导剂。12动物细胞培养需满足的条件有充足的营养、适宜的
3、温度和 pH、气体及无菌、无毒的环境。13单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高，并可以大量制备的优点。14诱导动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电激等。15早期胚胎发育的过程：受精卵卵裂期桑椹胚囊胚原肠胚。16胚胎的早期培养所需培养液的成分包括：无机盐、有机盐(两盐)；维生素、激素(两素)；氨基酸、核苷酸(两酸)以及水、血清等。17胚胎移植的基本程序：对供、受体的选择和处理配种或进行人工授精对胚胎的收集、检查、培养或保存胚胎移植移植后的检查。18胚胎移植过程中两次使用激素，第一次用孕激素对供、受体进行同期发情处理，第二次用促性腺激素对供体进行超数排卵处理。19生态工程建设的目的是遵
4、循自然界物质循环的规律，充分发挥资源的生产潜力，防止环境污染，达到经济效益与生态效益的同步发展。20生态工程所遵循的基本原理有物质循环再生原理、物种多样性原理、协调与平衡原理、整体性原理及系统学和工程学原理。澄清思维误区关注点 1 对基因工程中的“载体”与细胞膜上的“载体”区分不清澄清 基因工程中的载体是 DNA 分子，其功能是携带目的基因进入受体细胞；细胞膜上的载体是蛋白质，其功能是协助某些物质进出细胞。关注点 2 误认为限制酶是一种酶澄清 限制酶是一类酶，而不是一种酶。关注点 3 误认为启动子是起始密码子(RNA)，终止子是终止密码子(RNA)澄清 启动子(DNA 片段)起始密码子(信使
5、RNA 上的三个相邻碱基)；终止子(DNA片段)终止密码子(信使 RNA 上的三个相邻碱基)。关注点 4 对蛋白质工程的实质与基因工程的实质认识不清澄清 蛋白质工程是定向改造或生产人类所需蛋白质(可以为自然界中不存在的蛋白质)，而基因工程是定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(一般生产自然界中已存在的蛋白质)。关注点 5 误认为植物组织培养产生新个体属于有性生殖澄清 植物组织培养产生新个体不属于有性生殖，而属于无性繁殖，细胞分裂方式为有丝分裂，包括脱分化和再分化两个阶段。关注点 6 误认为获取细胞产品与人工种子的时期相同澄清 获取细胞产品的时期应为脱分化之后再分化之前的愈
6、伤组织，而制作人工种3子需要在再分化后形成的胚状体阶段。关注点 7 对植物组织培养与动物细胞培养的区别不明澄清 (1)植物组织培养和动物细胞培养都存在细胞的培养过程，但植物细胞可以先分裂再分化，而动物细胞只分裂不分化。(2)植物组织培养可以培养成新个体，动物细胞培养只能培养出一团细胞，不能培养成一个新个体。关注点 8 对受精标志与受精完成的标志认识不清澄清 (1)卵子是否受精的标志是第二极体的形成(即在透明带和卵细胞膜间隙观察到两个极体)。(2)受精完成的标志是雌雄原核融合成含二倍染色体的合子。关注点 9 误认为胚胎发育的过程中，细胞的全能性完全相同澄清 胚胎发育的过程中，细胞的全能性并非完全
7、相同，桑椹胚阶段的细胞具有全能性，囊胚是开始分化的阶段，原肠胚时期已出现高度分化。随着个体的发育，细胞的全能性越来越低。关注点 10 对胚胎移植中的“同种”认识不清澄清 同种动物之间进行胚胎移植易成功。这里的“同种”是指“同一物种” 。关注点 11 误认为胚胎分割是有性生殖澄清 胚胎是由受精卵形成的，属于有性生殖； 胚胎分割技术属于无性生殖，也属于克隆。关注点 12 认为不同的生态工程所依据的原理相同澄清 建立不同的生态工程时要依据不同的原理，因地制宜，不能相互照搬。关注点 13 误认为实现生态经济有时可以不遵循生态学的基本原理澄清 实现生态经济一定要遵循生态学的基本原理，如果违背这些原理，就
8、会使生态系统偏离稳态，甚至导致生态系统崩溃。关注点 14 误认为污染物是不能利用的资源澄清 对环境造成危害的污染物，采取一定的措施和技术，就能够进行回收和循环利用，这样不但能够减少环境污染，而且能提高资源的利用率，减少资源的浪费。关注点 15 误认为提高能量利用率提高能量传递效率澄清 提高能量的利用率，可通过缩短食物链和能量的多级利用来实现。提高能量的传递效率，需通过提高下一营养级的同化量来实现。4Error!2 个主攻点之(一) 基因工程和克隆技术专 题 复 习一、基因工程1基因工程的基本工具(填图)2基因工程的基本操作程序(填空)(1)目的基因的获取途径：方法 具体操作直接分离从自然界已有
9、的物种中分离，如从 基因文库中获取化学方法已知核苷酸序列的 较小基因，直接利用 DNA 合成仪用化学方法合成，不需要模板逆转录法以 RNA 为模板，在 逆转录酶作用下人工合成人工合成 PCR技术扩增原理：DNA 复制条件：模板 DNA、 引物、脱氧核苷酸、 热稳定的DNA 聚合酶(2)基因表达载体重组质粒的构建：表达载体的组成：目的基因启动子终止子标记基因复制原点。启动子和终止子：启动子是 RNA 聚合酶结合位点，启动转录；终止子是终止转录的5位点。(3)将目的基因导入受体细胞：植物细胞 动物细胞 微生物细胞常用方法 农杆菌转化法、基因枪法、 花粉管通道法 显微注射技术 Ca 2 处理法受体细
10、胞受精卵、体细胞 受精卵 原核细胞(4)目的基因的检测与鉴定：导入检测：DNA 分子杂交技术(使用 DNA 探针)。表达检测Error!个体生物学水平鉴定，如对转基因作物进行抗虫或抗病等接种实验。3蛋白质工程(填空)二、克隆技术1植物组织培养技术(填图)2动物细胞培养(填图)3动物体细胞克隆技术(填图)64动物细胞融合与单克隆抗体(填图)考向(一) 基因工程的操作工具、原理及过程真题导向1(2014江苏高考，多选)下列关于基因工程技术的叙述，错误的是( )A切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别 6 个核苷酸序列BPCR 反应中温度的周期性改变是为了 DNA 聚合酶催化不同的反应C载体质粒通
11、常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达解析：选 ABC 限制性核酸内切酶大多特异性识别 6 个核苷酸序列，但并非都只识别6 个核苷酸序列；PCR 中耐高温的 DNA 聚合酶只是在延伸阶段发挥催化作用；载体质粒上抗生素抗性基因可作为标记基因，供重组 DNA 的鉴定和选择，而不是抗生素合成基因；目的基因导入受体细胞后不一定都能正常表达。2(2017江苏高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR 扩增过程示意图如下，请回答下
12、列问题：(1)从高表达 MT 蛋白的生物组织中提取 mRNA，通过_获得_用于 PCR 扩7增。(2)设计一对与 MT 基因两端序列互补配对的引物(引物 1 和引物 2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的_位点。设计引物时需要避免引物之间形成_，而造成引物自连。(3)图中步骤 1 代表_，步骤 2 代表退火，步骤 3 代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR 扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但_的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果 PCR 反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_(填
13、序号：升高退火温度 降低退火温度 重新设计引物)。解析：(1)PCR 技术可在体外对 DNA 进行扩增，模板可以是 mRNA 经过逆转录获得的cDNA。(2)设计一对与 MT 基因两端序列互补配对的引物(引物 1 和引物 2)时，需在引物中增加适当的限制性核酸内切酶的识别序列，便于目的基因与质粒的连接。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据 PCR 的过程可知，图中步骤1 为变性，步骤 2 为退火(复性)，步骤 3 为延伸，这三个步骤构成一个循环。(4)退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，过高的退火温度会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C 之间的氢键数多于
14、 A、T 之间的氢键数，故 GC 含量高的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果 PCR 反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高使扩增效率降低，也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，因此可以采取的措施是降低退火温度、重新设计引物等。答案：(1)逆转录 cDNA (2)限制性核酸内切酶 碱基互补配对 (3)变性 (4)引物与模板 GC 含量高 (5)拓 知 识 解 读 PCR技 术(1)原理：利用 DNA 双链复制的原理，在体外将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。(2)条件及作用：条件 作用在一定的缓冲液中进行 提供相对稳定的 pH 环境四种脱氧核苷酸
15、 作为合成 DNA 子链的原料DNA 母链 作为 DNA 复制的模板Taq DNA 聚合酶 催化合成 DNA 子链引物 使 DNA 聚合酶能够从引物的 3端开8始连接脱氧核苷酸9095 变性：使 DNA 片段双链解开5560 复性：使解开的两条 DNA 单链分别与相应的引物结合温度控制7075 延伸： Taq DNA 聚合酶催化子链合成(3)解题规律总结：模型图示：规律总结：循环数 第一轮 第二轮 第三轮 第 n 轮DNA 分子数 2 4 8 2n含引物的 DNA 分子数 2 4 8 2n含引物 A(或 B)的DNA 分子12 11 32 21 72 31 2n1同时含引物 A、B的 DNA
16、分子数02 12 22 22 62 32 2n2共消耗的引物数量 22 22 62 32 142 42 2n1 2含与脱氧核苷酸链等长的 DNA 分子数02 12 02 24 22 36 2n2 nDNA 分子种类 2 4 5 53(2016江苏高考)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：9限制酶 BamH Bcl Sau3A Hind识别序列及切割位点图 1图 2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，
17、需将其转入处于_态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用 PCR 鉴定，所用的引物组成为图 2 中_。(3)若 BamH酶切的 DNA 末端与 Bcl酶切的 DNA 末端连接，连接部位的 6 个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能” “都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用 Sau3A切图 1 质粒最多可能获得_种大小不同的 DNA 片段。解析：(1)基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时，应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留一个”的基本原则，最好选择切割产生不
18、同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为 Bcl和 Hind，切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。酶切后的载体和目的基因通过 DNA 连接酶的作用形成重组质粒，重组质粒需要导入 Ca2 处理后的处于感受态的大肠杆菌(处于感受态的大肠杆菌细胞膜的通透性大大增加，便于重组质粒进入)。(2)由上述分析可知，为了筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，应先配制含四环素的选择培养基，平板上长出的菌落为导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌菌落，进一步鉴定出导入重组质粒的大肠杆菌，可利用 PCR扩增的方式,结合电泳技术来分析处理。DNA 的
19、两条链是反向平行的,在 PCR 过程中，当引物与 DNA 母链通过碱基互补配对结合后,DNA 聚合酶只能从引物的 3端延伸 DNA 链,因此应10选择引物甲和引物丙。(3)因为 Bcl和 BamH酶切产生的黏性末端相同,所以可以被 DNA连接酶连接,连接部位的 6 个碱基对序列为 ，但是连接后形成的DNA 中不再具有 Bcl和 BamH的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。(4)由图可知，能被限制酶 Bcl和 BamH切割的序列也能被 Sau3A识别并切割，因此图中质粒上存在3 个 Sau3A 的切割位点，若将 3 个切割位点之间的 DNA 片段分别编号为 a、 b 和 c，则完全酶切(3
20、个切割位点均被切割)会产生 3 种大小的 DNA 片段，即为 a、 b 和 c；考虑只切 1个切割位点，有三种情况，都产生一种大小的 DNA 片段，即大小均为 a b c；考虑切 2个切割位点，则会产生 a b、 c、 a c、 b、 b c、 a 几种不同大小的 DNA 片段。综上所述，若用 Sau3A识别并切割图中质粒，最多可获得 7 种大小的 DNA 片段，即为a b c、 a b、 a c、 b c、 a、 b、 c。答案：(1) Bcl和 Hind DNA 连接 感受 (2)四环素 引物甲和引物丙 (3) 都不能 (4)7拓 知 识 基 因 工 程 中 的 限 制 酶 和 DNA连
21、接 酶(1)基因工程中有 3 种工具，但工具酶只有 2 种。限制酶是一类酶，不是一种酶。限制酶的化学成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(2)在切割含目的基因的 DNA 分子时，需用限制酶切割两次此 DNA 分子，产生 4 个末端。(3)限制酶和 DNA 连接酶的作用部位都是脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键(不是氢键), 只是一个切开，一个连接。限制酶不切割自身 DNA 的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(4)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。(5)为使目的
22、基因与载体形成相同的 DNA 片段末端连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同的限制酶切割 DNA 分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。过关练习1.将经过扩增的 DNA 和质粒用相同的限制酶进行如右图所示的切割，电泳得到纯净的 B 片段和 D 片段，将两种片段置于适宜的缓冲液中用DNA 连接酶处理。如果只考虑两个片段的环状连接，则能形成不同核苷酸序列的环状 DNA 的种类是( )A6 种 B3 种11C2 种 D1 种解析：选 A 只考虑两个片段的环状连接，能形成的环状 DNA 有
23、B 片段与 B 片段同向连接的、B 片段与 B 片段反向连接的、D 片段与 D 片段同向连接的、D 片段与 D 片段反向连接的、B 片段与 D 片段同向连接的及 B 片段与 D 片段反向连接的，共 6 种。2(2018徐州模拟)下列有关基因工程技术的叙述，正确的是( )A不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不同BPCR 反应中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关C在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体D质粒上的目的基因都必须整合到受体细胞的 DNA 上才能表达解析：选 C 不同的限制酶切割形成的黏性末端可能相同，也可能不同；PCR 反应中周期性的温度可在一定范围内设置，
24、不是特定的；在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体，这样获得基因表达载体的概率更高；质粒本身是 DNA，也能自我复制，所以进入受体细胞以后，既可以自己进行表达，也可以整合到受体细胞的 DNA 上并表达。3下图为绿色荧光小鼠制备流程图，Gfp 是绿色荧光蛋白基因。请据图回答问题：(1)据图分析可推知，载体上的 Neo 为_基因，其表达产物可与_发挥作用而最终将_的胚胎干细胞筛选出来。 (2)完成过程需要的工具酶是_，完成过程常用的方法是_，完成过程后，胚胎干细胞应与囊胚中的_部位相结合。 (3)进行过程之前，要对代孕母鼠用某种激素处理，目的是_。 (4)胚胎干细胞的培养装置应置于_的气
25、体环境中，以保证培养环境pH 的相对稳定。 解析：(1)根据题意知，Gfp 是目的基因，所以载体上的 Neo 为标记基因。根据题图可知，其表达产物可与 G418 发挥作用而最终将导入目的基因的胚胎干细胞筛选出来。(2)完成过程需要的工具酶是 DNA 连接酶，完成过程常用的方法是显微注射法，完成过程后，胚胎干细胞应与囊胚中的内细胞团部位相结合。(3)过程是胚胎移植，进行胚胎移植之前，要对代孕母鼠进行同期发情处理。(4)细胞培养液中通入含 5%的 CO2的空气可以保证12培养环境 pH 的相对稳定。答案：(1)标记 G418 导入目的基因 (2)DNA 连接酶 显微注射法 内细胞团 (3)使其同期
26、发情 (4)含一定量(5%)的 CO2考向(二) 综合考查基因工程的应用真题导向1(2018江苏高考)为生产具有特定性能的 淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了 淀粉酶基因(1 656 个碱基对)，利用基因工程大量制备 淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：(1)利用 PCR 技术扩增 淀粉酶基因前，需先获得细菌的_。(2)为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的_端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_。(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中_的设定与引物有关，_的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)变性
27、温度 退火温度 延伸温度 变性时间 退火时间 延伸时间(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码 淀粉酶的 mRNA 的部分碱基序列：图中虚线框内 mRNA 片段包含_个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有_种。(5)获得工程菌表达的 淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为 1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：13缓冲液50 mmol/LNa2HPO4KH2PO450 mmol/LTrisHCl50 mmol/LGlyNaOHpH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5酶相对活性(%)25.440.2
28、49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8根据上述实验结果，初步判断该 淀粉酶活性最高的条件为_。解析：(1)利用 PCR 技术扩增 淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组 DNA 作为模板，并依据 淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用 PCR 技术扩增 DNA 时，只能从 3端延伸 DNA 子链，为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的 5端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。(3)PCR 技术包括
29、变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定 PCR 反应中双链 DNA 的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的 DNA 单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在 1 kb 以内的延伸时间为 1 min 左右，34 kb 的延伸时间为 34 min。(4)图中虚线框内共含有24 个碱基，mRNA 上 3 个相邻的碱基编码 1 个氨基酸，故共包含 8 个密码子。虚线框后的第1 个密码子的第 1 个碱基是 U，第 2 和第 3 个碱基各有 4 种可能性，因此共有 16 种可能性。题干表明控制 淀粉酶的基因有 1 656
30、 个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3 种终止密码子为 UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有 16313(种)可能性。(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为 99.5%，对应的条件是 pH 为 8.5，缓冲液为 50 mmol/L TrisHCl。答案：(1)基因组 DNA (2)5 使 DNA 片段能定向插入表达载体，减少自连 (3) (4)8 13(5)pH 为 8.5，缓冲液为 50 mmol/L TrisHCl2(2015江苏高考)胰岛素 A、B 链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。下图 1 是该方法所用的基因表达载体，图 2 表示利用
31、大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白 A、B 分别表示 半乳糖苷酶与胰岛素 A、B 链融合的蛋白)。请回答下列问题：14(1)图 1 基因表达载体中没有标注出来的基本结构是_。(2)图 1 中启动子是_酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性基因的作用是_。(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有_。(4)半乳糖苷酶与胰岛素 A 链或 B 链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，其意义在于_。(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的 A 链或 B 链，且 半乳糖苷酶被切成多个肽段，这是因为_。(6)
32、根据图 2 中胰岛素的结构，请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是_，理由是_。解析：(1)基因表达载体中应具有启动子、目的基因、终止子、标记基因和复制原点。(2)启动子是转录过程中 RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达。图中的氨苄青霉素抗性基因充当了标记基因，可用含有氨苄青霉素的培养基筛选含有重组质粒的大肠杆菌。(3)构建基因表达载体时，需要用同种限制酶分别切割目的基因和载体，然后用 DNA 连接酶将目的基因和载体连接。(4)胰岛素肽链上具有蛋白酶的切割位点，会导致胰岛素被菌体内的蛋白酶降解，而通过融合表达将切割位点隐藏在内部可防止胰岛素的A、B 链
33、被菌体内的蛋白酶降解。(5)根据溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，并结合 半乳糖苷酶被切成多个肽段，获得了完整的胰岛素 A 链、B 链这一信息，可以推测半乳糖苷酶中必然含有多个甲硫氨酸，胰岛素 A 链、B 链不含甲硫氨酸。(6)每一条肽链的两个末端分别含有一个氨基和一个羧基，某些氨基酸的 R 基中也含有氨基，因此含两条肽链的胰岛素中至少含有 2 个游离的氨基。15答案：(1)终止子 (2)RNA 聚合 作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来 (3)限制酶和 DNA 连接酶 (4)防止胰岛素的 A、B 链被菌体内蛋白酶降解 (5)半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸，而胰岛素 A、B 链中不
34、含甲硫氨酸 (6)至少 2 个 两条肽链的一端各有一个游离的氨基，氨基酸 R 基团中可能还含有游离的氨基防 易 错 基 因 工 程 操 作 中 的 易 错 点(1)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。(2)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。(3)植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。(4)基因表达载体中，启动子(DNA 片段)起始密码子(信使 RNA 上的三个相邻碱基)；终止子(DNA
35、片段)终止密码子(信使 RNA 上的三个相邻碱基)。(5)基因表达载体的构建是最核心的一步，在体外进行。个体水平上的检测和鉴定是衡量基因工程操作是否成功的最简单最有效的方法。过关练习1甲型流感病毒为 RNA 病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在 2017 年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒 RNA 为模板，逆转录成对应 DNA 后，利用_技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的_，因此不能产生
36、子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊 tRNA 的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与_连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的_进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述 tRNA 的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加_的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊 tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊 tRNA 基因转录时，识别其启
37、动子的酶是_(单选)。A病毒的 DNA 聚合酶 B宿主的 DNA 聚合酶C病毒的 RNA 聚合酶 D宿主的 RNA 聚合酶解析：(1)体外进行 DNA 扩增采用的技术手段是多聚酶链式反应(PCR 技术)。将基因内16个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码子的序列后，在翻译时终止密码子提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体(运载体)连接后导入受体细胞。利用分子杂交技术，鉴定筛选获得成功表达目的 RNA 的细胞时，需提取宿主细胞的总 RNA。(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有
38、 Uaa，翻译将会在终止密码子处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入Uaa。转录时，识别启动子的酶为 RNA 聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的 RNA 聚合酶。答案：(1)PCR 多肽(或蛋白质) (2)载体 总 RNA (3)非天然氨基酸(Uaa) D 2(2019 届高三常州四校调研)如图为利用奶牛的乳汁生产胰岛素的流程图。回答下列问题：(1)质粒载体的基本组成单位是_，质粒载体作为基因工程的工具，应具备的条件有_(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除了满足上述基本条件外，还需要具有启动子和终止子。(2)据图分折
39、，最好选用_(填限制酶名称)分别切割含目的基因的 DNA分子和质粒分子。当胰岛素基因和质粒载体连接时，DNA 连接酶催化形成的化学键是_。(3)要使胰岛素基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体，而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_。将重组质粒导入受精卵的方法是_；经检测，胰岛素基因已导入受体细胞的基因组中，但转基因奶牛通过乳腺生物反应器未生产出胰岛素，根据中心法则分析，其原因可能是_。(4)通过乳腺生物反应器生产胰岛素，需提前对形成的受精卵进行筛选，保留含性染色体组成为_(填“XX”或“XY”)的类型。解析：(1)质粒载体是小型环状 DNA，其基本组成单位是脱氧核苷酸，质粒载体作为基因工
40、程的工具，应具备的条件有具有自我复制的能力、有一个至多个限制酶切割位点、含有标记基因。作为基因表达载体，除了满足上述基本条件外，还需要具有启动子和终止子。(2)据图分折，最好选用 Sma、 Pst分别切割含目的基因的 DNA 分子和质粒分子。当胰岛素基因和质粒载体连接时，DNA 连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(3)要使胰岛素基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体，而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因17是目的基因无复制原点，无表达所需的启动子。将重组质粒导入受精卵的方法是显微注射法；经检测，胰岛素基因已导入受体细胞的基因组中，但转基因奶牛通过乳腺生物反应器未生产出胰岛素，根据中心法则分
41、析,其原因可能是胰岛素基因的转录或翻译异常。(4)通过乳腺生物反应器生产胰岛素，需提前对形成的受精卵进行筛选，要选雌性的受精卵，故保留含性染色体组成为 XX 的类型。答案：(1)脱氧核苷酸 具有自我复制的能力、有一个至多个限制酶切割位点、含有标记基因 (2) Sma、 Pst 磷酸二酯键 (3)目的基因无复制原点和无表达所需的启动子 显微注射法 (目的基因的)转录或翻译异常 (4)XX考向(三) 克隆技术及应用真题导向1(2018江苏高考)花药离体培养是重要的育种手段。下图是某二倍体植物花药育种过程的示意图，下列叙述正确的是( )A为了防止微生物污染，过程所用的花药需在 70%乙醇中浸泡 30
42、 minB过程的培养基中需添加较高浓度的细胞分裂素以利于根的分化C过程逐步分化的植株中可筛选获得纯合的二倍体D过程应将炼苗后的植株移栽到含有蔗糖和多种植物激素的基质上解析：选 C 通常将花药用体积分数为 70%的酒精浸泡 30 s，立即取出，在无菌水中清洗；过程为脱分化形成愈伤组织的过程，所用培养基中细胞分裂素和生长素的比例应适中；过程为再分化，因用秋水仙素处理了由花药形成的愈伤组织细胞，故能筛选获得纯合的二倍体；过程应将炼苗后的植株移栽到土壤中。2.(2018江苏高考，多选)如图为细胞融合的示意图，下列叙述正确的是( )A若 a 细胞和 b 细胞是植物细胞，需先去分化再诱导融合Ba 细胞和
43、b 细胞之间的融合需要促融处理后才能实现Cc 细胞的形成与 a、b 细胞膜的流动性都有关Dc 细胞将同时表达 a 细胞和 b 细胞中的所有基因解析：选 BC 若 a 细胞和 b 细胞是植物细胞，应先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，然后再诱导融合；a 细胞和 b 细胞之间的融合需要借助物理、化学等方法处理后才能实现；细胞的融合与细胞膜的流动性有关；融合后的 c 细胞中的基因进行选择性表达，只能表达a、b 两细胞的部分基因。3(2014江苏高考)为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。 请回答下列问题：18(1)外植体经诱导后形成愈伤组织的过程称为_。(2)
44、在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和 pH 的变化如上图所示。细胞干重在 12 d 后下降的原因有_；培养液中蔗糖的作用是_、_。(3)多倍体愈伤组织细胞产生的次生代谢产物量常高于二倍体。二倍体愈伤组织细胞经_处理，会产生染色体加倍的细胞。为检测愈伤组织细胞染色体数目，压片前常用纤维素酶和_酶解离愈伤组织。若愈伤组织细胞(2 n)经诱导处理后，观察到染色体数为 8n 的细胞，合理的解释是_、_。(4)为了更好地获得次生代谢产物，生产中采用植物细胞的固定化技术，其原理与酵母细胞固定化类似。 下列说法正确的有_(填序号)。选取旺盛生长的愈伤组织细胞包埋必须在光照条件下培养培养过程中需通空气固定化后植物细胞生长会变慢解析：(1)外植体是植物体离体的组织、器官或细胞，诱导形成愈伤组织的过程称为脱分化。(2)在培养过程中，蔗糖除为细胞提供能源，还具有调节渗透压的作用。随着蔗糖的消耗，营养供应减少，同时，细胞代谢产物、废物增加，使
