1、ICS 11.220 B 41 DB35 福建省 地方标准 DB35/T 1852 2019 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 Detection methods of real-time RT-PCR for Porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2019 - 09 - 11 发布 2019 - 12 - 11 实施 福建省市场监督管理局 发布 福 建 省 地 方 标 准 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 DB35/T 1852 2019 * 2019 年 9 月第一版 2019 年
2、 9 月第一次印刷 DB35/T 1852 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 缩略语 . 1 4 疾病概述 . 1 5 实验室诊断 . 2 6 综合判定 . 4 附录 A（规范性附录） 试剂的配制 . 5 附录 B（资料性附录） 扩增产物参考基因序列 . 6 DB35/T 1852 2019 II 前 言 本标准 按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由福州海 关提出并归口。 本标准起草单位：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心、深圳市易瑞生物技术有限公司、厦门 瑞德利校准检测技术有限公司、东莞市中鼎检测技术有限公司、深圳
3、市中鼎检测技术有限公司。 本标准主要起草人：郑腾 、 张体银 、 朱海 、 杨荣淇 、 付辉 、 张险朋 、 柯丽群 、 张志灯 、 林杰 、 林季敏 、 王武军 、 唐寰宇 、 张婷 、 白泉阳。 DB35/T 1852 2019 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR检测方法 。 本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行病病学调查、监测和诊断。 2 规范性引用 文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的
4、修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 Ct值 ： 循环阈值 （ Cycle Threshold） DEPC： 焦碳酸二乙酯 （ Diethy Pyrocarbonate） PRRS：猪繁殖与呼吸综合征（ Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome） PRRSV： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 （ Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus） RNA： 核糖核酸 （ Ribon
5、ucleic Acid） RT-PCR： 反转录聚合酶链式反应 （ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction） 4 疾病概述 4.1 病原 PRRS是 PRRSV引起的猪的一种高度传染性疾病，又称“猪蓝耳病”。 PRRSV为动脉炎病毒属的成员， 是一种有囊膜的单股正链 RNA病毒 ， 病毒粒子 呈球型，直径为 55 nm 60 nm。病毒有 2个 血清型 ，即美洲 型和欧洲型，我国分离到的毒株为美洲型。病毒对酸、碱都较敏感，尤其很不耐碱，一般的消毒剂对其 都有作用，但在空气中可以保持 3周左右的感染力。 4.2 流行病学 PRRSV可感染各
6、种品种、不同年龄和用途的猪，以妊娠母猪和 1月龄以内的仔猪最易感。患病猪和带 毒猪是本病的重要传染源。主要传播途径是接触感染、空气传播，也可通过胎盘垂直传播。持续性感染 是 PRRSV流行病学的重要特征。 PRRSV可在感染猪体内存在很长时间。猪在感染病毒后 2 14周均可通过 接触将病毒传播给其 它易感猪。 DB35/T 1852 2019 2 4.3 临床诊断 妊娠后 3个月的母猪如果感染 PRRSV，则会表现流产、早产、胎儿自溶和木乃伊等典型特征。出生前 后感染 PRRSV的新生仔猪，呼吸困难、急促，同时出现眼周及眼睑水肿，结膜炎，蓝耳，食欲不振，发 热，皮肤红斑，腹泻，震颤，毛发粗乱，
7、厌食和神经症状。断乳仔猪感染 PRRSV的典型临床症状表现为 发热、肺炎、昏睡及精神萎靡，如果伴发细菌感染，则死亡率显著升高。 5 实验室诊断 5.1 设备、材料和试剂 5.1.1 设备 5.1.1.1 台式冷冻高速离心机（转速至少达到 12 000 r/min 以上）。 5.1.1.2 微量可调移液器（ 100 L 1 000 L、 20 L 200 L、 2 L 20 L、 0.5 L 10 L）。 5.1.1.3 冰箱（ 2 8 和 -20 ）。 5.1.1.4 荧光定量 PCR 仪。 5.1.2 材料和试剂 5.1.2.1 试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格要求。 5.
8、1.2.2 焦炭酸二乙酯处理水（ DEPC 水）。 5.1.2.3 Trizol。 5.1.2.4 三氯甲烷。 5.1.2.5 异丙醇。 5.1.2.6 无水乙醇。 5.1.2.7 2 Taq PCR Master Mix。 5.1.2.8 荧光 RT-PCR 检测用引物和探针序列为： a) PRRSV-F 5-CACTACGGTCAACGGCACATT-3； b) PRRSV-R 5-GCATATTTGACAAGGTTTACCACTCC-3； c) PRRSV-P FAM-CTTTTCTGCCACCCAACACGAGGCTT-MGB。 扩增片段约 99 bp，用水溶解至 10 mol/L后，
9、保存于 -20 备用。 5.1.2.9 质控物质 ： 阳性对照为含 PRRSV 基因目的片段的质粒 DNA；阴性对照为不含 PRRSV 基因的质 粒 DNA 或含非 PRRSV 基因的质粒 DNA； DEPC 水为空白对照。 5.2 样品的采集、处理、存放和运输 5.2.1 样品采集和前处理过程的注意事项 采样及样品前处理过程过程中样品不得交叉污染，应戴一次性手套、口罩和帽子，采样工具使用前 先 消毒处理。 DB35/T 1852 2019 3 5.2.2 样品的采集和前处理 5.2.2.1 棉拭子样品 采样时将棉拭子探入鼻腔来回刮取 3 5次，取鼻腔分泌物；将棉拭子探入肛门旋转并沾取粪便；
10、将 鼻腔拭子和肛门拭子一起放入盛有 1.0 mL拭子悬液（ 符合 附录 A中 A.1的规定 ）的无菌 Eppendorf管中， 4 下 5 000 r/min离心 10 min，取上清液备用。 5.2.2.2 组织样品 采集有明显病变的淋巴结、扁桃体、肺、脾、肾、胸腺等组织样品，无菌取 0.5 g样品研磨后， 加 0.3 mL 0.5 mL的组织悬液（ 符合 附录 A中 A.2的规定 ）进行匀浆混匀，转入无菌 Eppendorf管中， 4 下 5 000 r/min离心 10 min，取上清液备用。 5.2.2.3 血清样品 取耳静脉或前腔静脉血 3 mL 5 mL，待析出血清后，直接吸取血清
11、备用。 5.3 病毒 RNA 的提取 在实验室操作过程中首先应严格遵守 GB 19489的要求。分别取 200 L待检样品，加入 1 mL Trizol 试剂，用移液器充分吹打 10 20次，室温放置 5 min；加入 200 L三氯甲烷，旋涡振荡 30 s混匀， 室温 放置 15 min； 4 下 12 000 r/min离心 15 min；取上层水相加入等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀， -20 放置 20 min； 4 下 12 000 r/min离心 15 min；弃上清液，沉淀用 1 mL75乙醇清洗； 10 000 r/min 离心 10 min， 弃上清液，沉淀室温干燥 5 min
12、；加 20 L DEPC水溶解 RNA沉淀。 -20 冰箱保存备用， RNA溶液应避免反复冻融，并尽快用于检测。空白对照、阴性对照和阳性对照进行同步操作。 RNA提取也可采用等效的商品化 RNA提取试剂盒。 5.4 实时荧光 RT-PCR 扩增 5.4.1 反应体系 在 0.2 mL PCR反应管中分别加入如下试剂： 2 Taq PCR Master Mix 12.5 L； 10 mol/L的正向 引物、反向引物和探针各 0.5 L；模板 RNA 5 L，随后加 DEPC水至总体积 25 L， 混匀，瞬时离心 5 s。 5.4.2 反应程序 将 PCR反应管放入荧光定量 PCR仪，扩增反应条件
13、设定： 50 逆转录 15 min； 94 预变性 3 min； 之后 94 变性 10 s， 60 退火 30 s，共 40个循环；后 4 保温。同时设立阳性、阴性对照和空白对照。 5.4.3 结果判定 综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚好超 过正常阴性对照扩增曲线 的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择 FAM通道进行分析。 阳性对照样品有对数扩增曲线，而且 Ct值 30；阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且 Ct值 40 或未检出，二者均成立才可判定试验成立。 检验样本 Ct值 35时，报告为猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性 。 检验样本
14、 35 Ct值 40时，重复一次，如果 Ct值仍然 40，并且曲线有明显的对数增长期，报告为 猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性，否则报告为猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性 。 样本 Ct值为零或 Ct值 40时，报告未检出猪繁殖与呼吸综合征病毒。 DB35/T 1852 2019 4 5.4.4 测序 需要时可以对 RT-PCR产物进行测序，参考序列 参 见附录 B，同源性应达到 98 以上。 6 综合判定 经实时荧光 RT-PCR检测为阳性，若出现临床症状，可判定患有猪繁殖与呼吸综合征；若无临床症状， 判定为 PRRSV携带者。 仅有临床症状，但实时荧光 RT-PCR检测为阴性则不能称患有猪繁殖与呼吸综
15、合征， 应 进一步做其他 病检查。 DB35/T 1852 2019 5 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 拭子悬液 在 0.01 mol/L PBS中添加青霉素（ 10 000 IU/mL）、链霉素（ 10 mg/mL）、庆大霉素（ 250 pg/mL） 和制霉菌素（ 5 000 IU/mL），调节 pH至 7.2 7.4。 A.2 组织悬液 在 0.01 mol/L PBS中添加青霉素（ 2 000 IU/mL）、链霉素（ 2 mg/mL）、庆大霉素（ 50 pg/mL）和 制霉菌素（ 1 000 IU/mL），调节 pH至 7.2 7.4。 DB35/T 1852 2019 6 B B 附 录 B （资料性附录） 扩增产物参考基因序列 CACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGTGGTAAAC CTTGTTAAATATGC _
