1、ICS 65.120 B 25 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 4045.3 2020 饲草中主要农药残留及真菌毒素的测定 第 3 部分：饲草中伏马毒素的测定方法 液 相色谱 -串联质谱法 Determination of main pesticide residues and mycotoxin in fodder grass Part3： Determination of fumonsins in fodder grass by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2020 - 07 -
2、09 发布 2020 - 08 - 09 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4045.3 2020 I 前 言 DB37/T 4045饲草中主要农药残留及真菌毒素的测定分为三个部分： 第 1部分：饲草中 10种杀虫剂农药残留量的测定 气相色谱 -串联质谱法； 第 2部分：饲草中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱 -串联质谱法； 第 3部分：饲草中伏马毒素的测定方法 液相色谱 -串联质谱法。 本部分为 DB37/T 4045的第 3部分。 本部分按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本部分由山东省畜牧兽医局提出并 组织实施。 本部分由山东省畜牧业标准化技术
3、委员会归口。 本部分起草单位：山东省农业科学院农业质量标准与检测 技术研究所。 本部分主要起草人：李增梅、李霞、邓立刚、官帅、陈璐、杨琳琳、王峰恩。 DB37/T 4045.3 2020 1 饲草中主要农药残留及真菌毒素的测定 第 3 部分：饲草中伏马毒 素的测定方法 液相色谱 -串联质谱法 警示：整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光 (阳光 )，具备相对独立的操作台和废 弃物存放装置。在整个实验过程中，操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。 1 范围 本标准规定了饲草中伏马毒素的液相色谱 -串联质谱测定方法。 本标准适用于饲草中伏马毒素 B1和伏马毒素 B2含量的测定。
4、 本方法检出限为 10 g/kg，定量限为 20 g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样经乙腈 -甲酸水溶液提取，经 QuEChERS萃取包净化后，氮气吹干，甲醇 -水溶液复溶，液相色谱 分离，串联质谱检测，内标法定量。 4 试剂与材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水符合 GB/T 6682一级水的规定。 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 甲酸：色谱纯。 4.3 乙腈：色谱纯
5、。 4.4 提取液：量取乙腈（ 4.3） 800 mL，加入甲酸（ 4.2） 10 mL，用水定容至 1 000 mL。 4.5 甲醇溶液：量取甲醇（ 4.1） 100 mL，加入水 100 mL，混匀，备用。 4.6 伏马毒素 B1（ FB1， C34H59NO15， CAS： 116355 - 83 - 0）标准溶液： 100 g/mL。 4.7 伏马毒素 B2（ FB2， C34H59NO14， CAS： 116355 - 84 - 1）标准溶液： 100 g/mL。 4.8 伏马毒素 B1同位素内标（ 13C34-FB1， 13C34H59NO15）溶液： 25 g/mL。 4.9 伏
6、马毒 素 B2同位素内标（ 13C34-FB2， 13C34H59NO14）溶液： 10 g/mL。 4.10 混合标准中间溶液：准确吸取 1 mL 伏马毒素 B1标准溶液（ 4.6）和 1 mL 伏马毒素 B2（ 4.7）标 准溶液于 10 mL 容量瓶中，用水定容，此时伏马毒素 B1和伏马毒素 B2浓度为 10 g/mL，于 -20 冰箱 保存。 DB37/T 4045.3 2020 2 4.11 混合同位素内标工作溶液：准确吸取 0.1 mL 伏马毒素 B1同位素内标溶液（ 4.8）和 0.1 mL 伏马 毒素 B2同位素内标溶液（ 4.9）于 5 mL 容量瓶中，用水定容，此时伏马毒素
7、 B1同位素内标溶液浓度为 0.5 g/mL，伏马毒素 B2同位素内标溶液浓度为 0.2 g/mL，于 -20 冰箱保存。 4.12 QuEChERS 盐包： 4 g 硫酸镁， 1 g 氯化钠， 1 g 柠檬酸钠， 0.5 g 柠檬酸二钠盐倍半水合物。 4.13 微孔滤膜：有机相， 0.22 m。 5 仪器与设备 5.1 液相色谱 三重四级杆质谱联用仪：配电喷雾离子源（ ESI 源）。 5.2 分析天平：感量 0.01 g。 5.3 高速匀浆机：转速不低于 10 000 r/min。 5.4 离心机：转速不低于 8 000 r/min。 5.5 氮吹仪，可控温。 5.6 粉碎机。 5.7 涡旋
8、混合器。 5.8 恒温振荡器。 6 试样的制备 样品粉碎后充分混匀，于 18 下保存。 7 测定步骤 7.1 前处理 准确称取平行试样，干样 2 g或鲜样 5 g于 50 mL具塞离心管中，加入 20 mL提取溶液（ 4.4），涡旋 混匀后于恒温振荡器中振荡 30 min；加入 QuEChERS盐包（ 4.12），涡旋 2 min，充分混匀， 8 000 rpm 离心 5 min，取 2 mL上清液，加 25 L同位素内标溶液（ 4.11）于 40 水浴中氮吹至近干；用甲醇溶液 （ 4.5）溶解，定容至 0.5 mL，旋涡振荡 1 min，过微孔滤膜，用于测定。 7.2 仪器参考条件 7.2.
9、1 液相色谱参考条件 液相参考条件如下： a) 色谱柱： C18色谱柱，柱长 100 mm，柱内径 2.1 mm，颗粒内径 1.7 m，或相当者； b) 流动相： 0.1 %甲酸水（流动相 A），乙腈（流动相 B）； c) 流速： 0.3 mL/min； d) 进样量： 2 L； e) 柱温： 40 ； f) 流动相及梯度洗脱条件见表 1。 DB37/T 4045.3 2020 3 表 1 流动相梯度洗脱条件 时间 min 流动相 A 流动相 B 90 10 0.2 90 10 2.0 10 90 4.0 10 90 4.5 90 10 7.0 90 10 7.2.2 质谱参考条件 质谱参考条
10、件如下： a) 离子源：电喷雾离子源 ( ESI）； b) 毛细管电压： 3.5 KV； c) 离子源温度： 120 ； d) 脱溶剂气温度： 500 ； e) 扫描模式：正离子； f) 监测方式：多反应监测（ MRM），监测条件见表 2。 表 2 多反应监测（ MRM）条件 化合物 名称 母离子 m/z 锥孔电压 V 定量离子对 m/z 碰撞能量 eV 定性离子对 m/z 碰撞能量 eV FB1 722.4 30 334.4 40 352.4 32 FB2 706.5 40 318.4 38 336.4 38 13C 34-FB1 756.5 30 356.5 28 13C 34-FB2 7
11、40.5 40 358.4 30 7.2.3 标准曲线的绘制 准确吸取适量混合标准溶液和混合同位素内标溶液，用初始流动相配制成 2 g/L、 5 g/L、 10 g/L、 50 g/L、 100 g/L混合标准溶液系列，其中 FB1同位素内标溶液浓度为 25 g/L， FB2同位素内 标溶液浓度为 10 g/L，上机测定，绘制标注曲线。 7.3 定性及定量 7.3.1 定性测定 通过试样色谱图的特征离子与相应对照溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准品保留时 间的相对误差不大于 2.5 %；试样特征离子的相对离子丰度与标准品特征离子的相对离子丰度 一致，相 对离子丰度偏差不超过表 3的规
12、定，则可判断试样中含有伏马毒素 B1和伏马毒素 B2。 表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 相对离子丰度 50 % 20 % 50 %（含） 10 % 20 %（含） 10 % 允许的相对偏差 20 25 30 50 DB37/T 4045.3 2020 4 7.3.2 定量 外标法定量。 7.4 试样溶液的测定 将基质标准工作溶液和试样溶液依次注入液相色谱 质谱联用仪中，保留时间和定性离子定性，测 定定量离子峰面积，待测样液中伏马毒素 B1和伏马毒素 B2的响应值应在仪器检测的定量测定线性范围之 内，超过线性范围时应根据 测定浓度进行适当倍数稀释后再进行分析。 7.5 空白试验 除
13、不加试料外，按照 7.1 7.4规定进行平行操作。 8 结果计算 试料中被测伏马毒素 B1和伏马毒素 B2残留量以质量分数计，单位以微克每千克（ g/kg）表示， 按公式（ 1）计算： 2 31 Vm VV . (1) 式中： 试料中被测物残留量，单位为微克每千克（ g/kg）； 从基质混合标准曲线上得 到的样液中伏马毒素 B1和伏马毒素 B2的质量浓度，单位为微克每升 （ g/L）； V1 样品提取液体积，单位为毫升（ mL）； V2 待浓缩的上清液体积（ mL）； V3 试样液最终定容体积（ mL）； m 试料的质量，单位为克（ g）。 计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算数平均值的 15 %。 DB37/T 4045.3 2020 5 A A 附 录 A （资料性附录） 伏马毒素及其同位素内标特征离子质量色谱图 伏马毒素 B1和伏马毒素 B2特征离子质量色谱图见图 1。 图 A.1 伏马毒素 B1、伏马毒素 B2液相色谱 -串联质谱多反应监测色谱图（标准溶液浓度为： 10 g/L） _
