1、ICS 65.020.30 B45 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3316 2018 鸡 J-亚群白血病实验室诊断技术 Laboratary Diagnostic Technique of Chicken Leukosis Virus Subgroup J (ALV-J) 2018 - 06 - 12发布 2018 - 07 - 12实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 3316 2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：山东农
2、业大学。 本标准主要起草人：成子强。 DB37/T 3316 2018 1 鸡 J-亚群白血病实验室诊断技术 1 范围 本标准规定了我省针对 ALV-J的检测诊断方法。 本标准 适用于判断鸡群是否患 J亚群白血病。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 禽白血病病毒 J亚群 Avian Leukosis Virus Subgroup J . ALV-J ALV-J属反转录病毒科甲型反转录病毒属，是单股正链 RNA病毒。 ALV-J主要特点是引起多种禽类免 疫抑制和髓细胞性白血病发生，对养鸡业威胁巨大。 2.2 抗原 /抗体检测 通过标准的酶联免疫吸附实验（ enzyme lin
3、ked immunosorbent assay， ELISA）检测 ALV-J的抗原 / 抗体。应用指定的商品化 ALV-J抗原 /抗体检测试剂盒，用血清检测 ALV-J抗体，用棉拭子检测 ALV-J群特 异性抗原（ p27）具体实验步骤参照 GB/T 26436。抗体及 p27均呈阳性，或二者之一呈阳性，可怀疑 ALV-J 感染。 2.3 PCR 聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction,PCR)。 2.4 RT-PCR 反转录 -聚合酶链反应（ reverse transcription PCR， RT-PCR）。 3 材料与试剂 3.1 常规使用的 ELISA抗
4、原 /抗体检测试剂盒 (IDEXX)。 3.2 常规使用的商品化的 RNA提取试剂盒。 3.3 常规使用的商品化 的 RNA反转录试剂盒。 3.4 各检测方法所需的试剂。 3.4.1 PBS缓冲液见附录 A中 A.1。 3.4.2 灭菌水。 DB37/T 3316 2018 2 3.4.3 蒸馏水。 3.4.4 细胞生长培养基见附录 A中 A.2。 3.4.5 细胞维持培养基见附录 A中 A.3。 除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯。 4 仪器与设备 4.1 全自动高温高压灭菌锅 (温度范围： 105-134；额定压力： 0.23Mpa)。 4.2 低速离心机。 4.3 PCR仪。 4.4
5、二氧化碳恒温细胞培养箱。 4.5 液氮储存罐。 4.6 研磨器。 4.7 手术剪。 4.8 各量程移液枪。 4.9 超低温冰箱。 4.10 酶标仪。 4.11 分光光度计 5 抽样 5.1 样品采集 5.1.1 组织样品的采集 按 1 %的比例，随机选取疑似 J亚群禽白血 病病鸡，用无菌手术剪分离肾脏、肝脏、脾脏等所需脏器 100 mg 分装于 1 mL 储存管内，并及时冻存于 -80 冰箱或液氮罐内备用。 5.1.2 血液样品的采集 用 2.5 mL无菌注射器于翅下静脉或颈静脉抽取 1 mL左右的静脉血，放入编号离心管内，倾斜静置， 待血液分离出血清后吸取血清于编号的离心管内，储存于 -20
6、 冰箱备用。 5.1.3 泄殖腔棉拭子的采集 用无菌棉签插入泄殖腔内，擦拭后将棉签放入装有 1 mL PBS缓冲液的离心管内，储存于 -20 冰箱 备用。 5.2 样品运输与存放 采集的样品应放入冻存管并放入冰盒内运输 ，然后上述 要求及时放入液氮罐或 -80 冰箱或 -20 冰箱储存。 6 操作方法 6.1 方法 DB37/T 3316 2018 3 6.1.1 抗原 /抗体检测 抗原 /抗体检测是采用美国 IDEXX 公司的 ELISA检测试剂盒检测。 6.1.1.1 样品处理 检测样品前，棉拭子应反复冻融 2 次 3 次， 4 ， 1006.2 g （ 3000转）离心 2 min 3
7、min，吸 取上清。血清样品于室温融化， 500 倍稀释，用于检测。 6.1.1.2 操作步骤 按照试剂盒提供的检测步骤操作。 6.1.1.3 结果判定 只要 p27抗原和 ALV-J抗体其中之一为阳性，需要进行下一步检测。 6.1.2 RT-PCR检测 通过对疑似病例组织 RNA提取，反 转录为 cDNA作为模板进行特异性 PCR检测。 6.1.2.1 RNA及 cDNA提取 将冻存于液氮罐内的组织用商品化试剂盒提取 RNA，用分光光度计测浓度后用商品化试剂盒反转录 成 cDNA。 RNA储存于 -80 冰箱， cDNA储存于 -20 冰箱。 6.1.2.2 操作步骤 先完成 RNA提取，具
8、体操作按照试剂盒提供的步骤即可，测定浓度，然后将 RNA反转录成 cDNA，以 cDNA 为模板，利用 ALV-J gp85片段的特异性扩增进行 PCR扩增，扩增产物于 120 V电压， 1 %琼脂糖凝胶电泳 检测。剩余的 RNA保存于 -80 冰箱， cDNA保存于 -20 冰箱。具体反应条件见附录 B。 6.1.2.3 结果判定 琼脂糖凝胶电泳中出现特异的 545 bp的片段条带时，进行下一步检测。 6.1.3 病毒分离 6.1.3.1 DF-1细胞传代培养 取生长状态良好的 DF-1细胞传代并用生长培养基培养至少 4 小时，待细胞密度达到 60 % 70 %后用 于病毒分离。 6.1.3
9、.2 组织研磨液制备 采用鸡肝脏 /肾脏 /脾与 DMEM培养液充分混合、研磨后，作为病毒研磨液，并用超声波破碎 90 循环， 每个循环工作时间 3 秒、间隔时间 2 秒，重复两次， 1006.2 g离心 3 min后，上清用 0.22 m的微孔滤 器过滤除菌。 6.1.3.3 病毒液感作 DF-1细胞 在二氧化碳培养箱培养了至少 4 h的 DF-1细胞倒掉生长培养基，将 1mL组织滤液注入培养瓶 /培养板 内，作用于 DF-1细胞，将细胞放在二氧化碳培养箱内作用 1h后更换细胞维持培养基，培养至少 7 天。 DB37/T 3316 2018 4 6.1.3.4 p27抗原检测 采用美国 ID
10、EXX 公司的 ELISA检测试剂盒检测 6.1.3.5 结果判定 p27抗原阳性，可判定为 ALV-J感染。 6.1.4 结果诊断 RT-PCR及病毒分离时 DF-1细胞上清 p27检测结果均为阳性时，可诊断为 ALV-J感染。 DB37/T 3316 2018 5 A A 附 录 A （规范性附录） 材料与试剂配制方法 A.1 PBS缓冲液 NaCl 8 g， KCl 0.2 g， Na2HPO4 1.42 g（ Na2HPO4 12H2O 3.58 g）， KH204 0.27 g溶于蒸馏水，定 容于 1000 mL，过滤后高压灭菌备用。 A.2 细胞生长培养基 达尔伯克必需基本培养基（
11、 Dulbeccos Minimum Essential Medium， DMEM）粉剂 1 包， NaHCO3 3.7 g，青链霉素双抗 10 mL，胎牛血清 100 mL，溶于蒸馏水，定容为 1000 mL，无菌高压滤器过滤，储存于 4 冰箱备用。 A.3 细胞维持培养基 达尔伯克必需基本培养基（ Dulbeccos Minimum Essential Medium， DMEM）粉剂 1包， NaHCO3 3.7 g，青链霉素双抗 10 mL，胎牛血清 10 mL，溶于蒸馏水，定容为 1000 mL，无菌高压滤器过滤，储存于 4 冰箱备用。 DB37/T 3316 2018 6 B B 附
12、 录 B （规范性附录） RT-PCR引物信息 禽白血病病毒 J亚群（ ALV-J） RT-PCR检测所需引物序列。 引物浓度均为 10 pmol。 引物名称 序列 长度 扩增目的 用途 上游引物 5 -GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3 545bp 禽白血病病毒 J亚群 （ ALV-J） gp-85基因 片段 扩增出的 gp-85特异 性片段进行琼脂糖凝 胶电泳检测 下游引物 5 -CGAACCAAAGGTAACACACG-3 DB37/T 3316 2018 7 C C 附 录 C （规范性附录） RT-PCR反应条件 C.1 反转录体系为：采用 20 L体系，在 PCR管中依次
13、加入 5X Prime Script Master Mix 4 L,模板 RNA x L（ x=1000/RNA浓度），用 RNase Free dH2O补足 20 L。 C.2 反转录条件为： 37 15 min， 85 5 s。 C.3 PCR反应体系为：反应总体系为 25 L，在 PCR管中依次 加入 ,2 Tap PCR MasterMix12.5 L， 1 0 pmol/ L的上下游引物各 0.5 L，模板 cDNA1 L，其余用灭菌水补至 25 L。 C.4 循环条件： 95 预变性 5 min， 94 变性 30 s， 53 退火 30 s， 72 延伸 45 s，进行 30个 循环，最后于 72 延伸 10 min。 4 保存。反应后， PCR产物取 7 L 8 L，在 2 %琼脂糖凝胶电泳 检测。 图 C.1 PCR扩增电泳结果（ N为阴性对照） _
