1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物 检材 中 林可霉素 检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for lincomycin in biological samples LC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术
2、委员会（ SAC/TC179/SC1） 提出并 归口。 本标准由起草单位：公安部物证鉴定中心 、深圳市公安局。 本标准 主要 起草人： 张云峰 、 王芳琳 、 黄健 、 王炯 、 常靖 、 王瑞花 、 董颖 、 张蕾萍 、 侯小平 、 栾玉 静 、 杜鸿雁 、 崔冠峰 、 于忠山 、 何毅 、李树辉。 GA/T 1 法庭科学 生物 检材 中 林可霉素 检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学生物检材 （血、尿、肝、肾、胃及胃内容等） 中 林可霉素 的液相色谱 -质谱 （ LC-MS） 定性定量 检验方法。 本标准适用于法庭科学生物检材中 林可霉素 的定性分析和定量分析。其他可
3、疑 样 品中 林可霉素 的 定性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以 空白样品和添加样品作对照，按平行操作的 要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相 色谱 -质谱法定性定量，以保留时间 、 质谱特征离子 和 离子丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据， 采用
4、 外标 法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的 一 级水。 在分析中使用的试剂均为 色谱 纯， 试剂包括： a) 甲醇； b) 乙腈； c) 甲酸； d) 二氯甲烷； e) 标准 溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液 ： 根据 林可霉素 标准物质的纯度， 称取适量， 用甲醇配制 1.0mg/mL 林可霉素 标准物质溶液，置于冰箱中 冷藏 保存。有效期 6 个月。或采用市售标准溶液； 2) 10.0g/mL 标准工作溶液：移取 1.0mg/mL 的 林可霉素 标准物质溶液 0.1mL，用甲醇 稀释 至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中
5、冷藏保存 。 有效期 3 个月。实验中所用其 他 浓度的标 准工作溶液均由 10.0g/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。 注： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 GA/T 2 5.2 材料 材料 包括 ： a) 具盖离心管 ； b) 具塞玻璃试管 ； c) 有机系微孔滤膜： 0.22m； d) 固相萃取柱： Oasis HLB 固相萃取 柱或 其他 等效固相萃取柱 ， 使用前依次用 甲醇 、 水活化 ； 注： Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产
6、品。 e) 一次性注射器 。 6 仪器 和 设备 仪器和设备 包括： a） 液相色谱 -质谱仪： 配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器 ； b） 电子 天平 ； c） 离心机； d） 振荡器 ； e） 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体检材样品 0.5mL，或称取铰碎的 肝脏等 固体检材样品 0.5g于 具盖离心管中 ， 加入 二 氯甲烷 3mL，振荡 5min， 8000r/min离心 10min，分离有机相，置于浓缩器上 50浓缩至干，残留物用 1mL 初始流动相溶解 ， 用 0.22m的 有机 系 微孔滤
7、膜过滤， 作为检材样品提取液 供 仪器 分析。 7.1.1.2 固相萃取 移取血液等液体检材样品 0.5mL，或称取绞碎的肝脏等固体检材样品 0.5g于具盖离心管中 ， 加 3mL 水 稀释 ， 振荡 10min， 8000r/min离心 20min，取上清液转移至已活化好的固相萃取柱中，控制上清液过 柱 ， 流速为 1mL/min，依次用 3mL水、 3mL甲醇 /水 （ 体积比 10:90） 淋洗，抽干弃 去淋洗液，挤干水分或 离心或真空抽固相萃取 柱 2min， 用 3mL甲醇 洗脱， 收集洗脱液并 置于浓缩器上 50 浓缩至干，残留物用 1mL初始流动相 溶解， 用 0.22m的 有机
8、 系 微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液 供 仪器 分析。 7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加林可霉素标准物质，作为添加样品 （添加样品 的浓度为 5.0ng/mL(g)）， 与检材样 品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 （液相色谱 -质谱） 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： GA/T 3 a） 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3 C18， (2.1mm50mm， 1.7
9、m)或等效 色谱 柱； 注： ACQUITY UPLC HSS T3 C18是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b） 流动相： A： 甲醇 ， B： 0.1%甲酸 水溶液 ； c） 洗脱 方式 ：梯度洗脱，梯度见表 1； d） 柱温： 35； e） 进样量： 2L； f） 流速： 0.6mL/min； 表 1 梯度洗脱条件 时间 min A B - 10% 90% 1.5 40% 60% 1.8 90% 10% 2.2 90% 10% 2.5 10% 90% 4.0 10
10、% 90% g） 离子源： 电喷雾电离源 （ ESI）； h） 检测方式：正离子； i） 毛细管电压： 3.5kV； j） 离子 源温度： 150； k） 雾化气流速： 800L/h； l） 雾化气温度： 400； m） 扫描 方式 ：多反应离子监测（ MRM）； n） MS 参考条件（ 定性、定量离子和锥孔电压、碰撞能量条件 ） 见表 2。 表 2 MS参考条件 名 称 定量离子 对 定性离子 对 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 林可霉素 407.2 126.1 407.2 126.1 30 30 407.2 359.2 20 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作
11、溶液，按 7.1.2.1 的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提取 移取血液等液体检材样品 0.5mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 0.5g两份，按 7.1.1进行操作。 内标 -工作曲线法： 另取等量相似基质的空白样品六份， 一份作为空白样品，另外五份 添加 不同浓 度的 标准物质 （添加浓度应呈良好的线性关系，且 检材样品中目标物的含量应在线性范围内 ） ，作为添 加样品，与检材样品平行操作。 GA/T 4 内标 -单点校正法： 另取等量相似基质的空白样品 两份 ， 一份作为空白样品，另外一份 添加标准物 质 （ 检材样品中目标物含量应为添加样品中目标物含量的 （
12、 10050） %） ，作为添加样品，与检材样品 平行操作。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液或基质标准工作溶液及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件 每个样品进样分析 2 3次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算 含量 7.2.3.1.1 外标 -单点法 记录各样品提取液平行进样 2 3 次 的 目标物保留时间和峰面积值，按公式（ 1）计算含量： 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材样品 中
13、目标物的含量，单位为微克每克 （ g/g） 或微克每毫升（ g/mL） ； A 样 检材 样品提取液 中目标物峰面积平均值； M 添 添加样品中 目标物 添加量，单位为微克 （ g） ； V 样 检材 样品 的定容体积，单位为毫升 （ mL） ； A 添 添加样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 样 检材 样品 的取样量，单位为克 （ g） 或毫升 （ mL） ； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升 （ mL） 。 7.2.3.1.2 外标 -标准曲线法 记录样品提取液和基质标准工作溶液平行进样 2 3次的目标物保留时间和峰面积值， 以 林可霉素 定量离子对的峰面积（ A样 ） 为纵坐
14、标、 林可霉素 质量浓度（ W）为横坐标进行线性回归，得线性方程， 按公式（ 2）计算含量。 若检材样品中目标物的含量高于线性范围，应将 检材样品提取液用甲醇稀释后 进样分析。 = 样 (2) 式中： W 检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（ g/mL）； A样 检材样品提取液中目标物峰面积 平均值 ； a 线性方程的截距； b 线性方程的斜率。 7.2.3.2 计算 相对相差 记录 2份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（ 3）计算相对相差： GA/T 5 %10021 = X XXRD . (3) 式中： RD 相对相差， 用百分比（ %）表示 ； X1、
15、 X2 两个样品平行定量测定的含量数值； X 两个样品平行定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性 结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的 标准溶液相比 ， 相对偏差不超过表 3规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 林可霉素的相关谱 图参见附录 A中图 A.1、图 A.2。 表 3 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 2
16、0 25 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色 谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 方法检出限参见附录 A。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按 两 份检材的平均值计算。 如果检材样品中目 标物含量的 RD20%，定量数据不可靠。应按 7.2重新提取检验。 林可霉素 中毒诊断参考资料 参见附录 B。 GA/T 6 A A 附 录 A （资料性附录） 林可霉素 的相关色谱图 A.1 林可霉素的 MRM总离子流图见图 A.1。 图 A.1 林可霉素
17、的 MRM总离子流图 A.2 林可霉素的 MRM提取离子流图见图 A.2。 图 A.2 林可霉素的 MRM提取离子流 图 A.3 LC-MS 分析 ，林可霉素 检 出 限为 2.0ng/mL(g)。 GA/T 7 B B 附 录 B （资料性附录） 林可霉素 中毒诊断参考资料 B.1 中毒症状 口服使用 林可霉素 容易出现消化系统症状和体征 ，如 常见恶心、呕吐、腹痛、腹泻等；严重者有 腹绞痛、腹部压痛、严重腹泻（水样或脓血样），伴发热、异常口渴和疲乏（ 假膜性肠炎 ） 。 在肌肉注射或静脉注射时，由于剂量使用不当或用药速度快，可导致林可霉素极性中毒反应， 用 药后立即出现颜面潮红、烦燥 ， 继而双眼凝视 、 昏厥 ， 脉搏血压测不出、缺氧、心音弱、心率快 、 全 身无力 、 舌头发麻 、 手脚发麻 、 呼吸困难 等中毒症状及体征反应 。 病理检验 ： 脑水肿及肺水 肿、心 肌炎等病理改变。 B.2 中毒死亡机理 林可霉素 中毒 具有神经肌接头阻断作用，可以引起血压下降、呼吸和心跳停止 发生休克样反应， 最终引起死亡 。 B.3 林可霉素 的中毒浓度 小鼠 静脉注射 为 214mg/kg，口服为 4000mg/kg；大鼠口服为 4000mg/kg。 _
