1、 ICS 13.020.40 CCS Z 10 44 广东 省 地方标准 DB44/T 2340.4 2021 诸氏鲻虾 虎鱼 毒理学评价 第4 部分：生殖毒 性 Mugilogobius chulae Toxicology evaluation Part 4: Reproduction toxicity 2021 - 10 - 18 发布 2022 - 01 - 18 实施 广东省市 场监督 管 理 局 发 布 DB44/T 2340.4 2021 I 目 次 . II 1 . 1 2 . 1 3 . 1 4 . 2 5 . 2 6 . 3 7 . 3 8 . 5 9 . 5 10 . 6
2、11 . 6 A . 7 B . 8 C VTG mRNA AR mRNA . 16 DB44/T 2340.4 2021 II 前 言 GB/T 1.1 2020 1 DB44/T 2340 1 2 3 4 DB44/T 2340 4 GD/TC 93 DB44/T 2340.4 2021 1 诸 氏鲻虾 虎鱼 毒 理学评 价 第 4 部 分：生 殖毒性 1 范围 2 规范性 引用 文件 GB/T 35517-2017 SN/T 3592 DB44/T 2340.1-2021 1 3 术语和 定义 生殖毒 性 reproductive toxicity 卵黄蛋 白原 vitellogenin
3、, VTG GB/T 35517-2017 2.1.3 雄激素 受体 androgen receptor, AR 最大耐 受浓 度 maximum tolerated concentration, MTC 10% GB/T 35517-2017 2.1.4 无可见 影响 浓度 no observed effect concentration, NOEC p 0.05 GB/T 18420.2 2009 3.2 DB44/T 2340.4 2021 2 最低可 观察 效应 浓度 lowest observed effect concentration, LOEC (p0.05) GB/T 218
4、28-2008 2.4 性腺指 数 gonad somatic index ，GSI GSI= GW/SW x 100 % GW g SW g 相对生 殖力 relative fecundity 孵化率 hatching rate 不投饵 存活 系数 survival activity index ，SAI SAI = ( N hi ) i / N K i = 1 N K Hi i 4 原理 VTG AR AR mRNA VTG mRNA AR mRNA 5 方法 20% 5.2.1 21 d VTG mRNA AR mRNA DB44/T 2340.4 2021 3 5.2.2 90 d 3
5、0 d 60 d 6 器材 主要仪 器设 备 6.1.1 6.1.2 pH 6.1.3 2.0 L 3.0 L 5.0 L 10.0 L 6.1.4 定量 PCR 仪 、 诸氏鲻 虾虎 鱼 6.2.1 性别、 规格 选择 A 25.0 2.0 16 2 20% 25.0 2.0 22 2 20% 6.2.2 质量 DB44/T 2340.1-2021 6.2.1 受试 物 DB44/T 2340.1-2021 6.3 7 评价步 骤 样品准 备 7.1.1 稀释水 DB44/T 2340.1-2021 7.1.1 7.1.2 贮备液 配制 DB44/T 2340.1-2021 7.1.2 预试
6、验 5 1 0.1 DB44/T 2340.4 2021 4 B B.1 96 h MTC 正式试 验 7.3.1 试验 溶 液配 制 0.1 MTC 3 3 10 0.1 g/L 17 - 0.1 g/L - 1.0 L 3 3 3 10 0.1 g/L17 - 0.1 g/L - 3.0 L 6.0 L 2 0.1 B B.1 7.3.2 诸氏鲻 虾虎 鱼移 入 5 h 24 h 5 10 30 min 7.3.3 试验环 境条 件 DB44/T 2340.1-2021 7.4.3 7.3.4 诸氏鲻 虾虎 鱼投 喂 30 0.2 mL 7.3.5 试验溶 液更 换 48 h 3/4 24
7、 h 24 h 5 10% 观察 和 记录 7.4.1 水质因 子测 定和 行为 、体 表特征 观察 pH B B.2 7.4.2 VTG mRNA 和AR mRNA 相 对 表达量 DB44/T 2340.4 2021 5 3 3 GB/T 35517 C VTG mRNA AR mRNA B B.3 B.4 7.4.3 性腺指 数 100 mg/L MS-222 B B.5 7.4.4 生殖力 B.6 7.4.5 孵化率 25 2 54 lx 524 lx 5 mg/L B.7 7.4.6 不投饵 存活 系数 100 2 DB44/T 2340.1-2021 B.2 B.8 SAI 8 质
8、量控 制 10% 23 27 0.1 g/L 17 - 21 d VTG mRNA p 0.05 0.1 g/L - 21 d AR mRNA p 0.05 2 50% 9 结果与 报告 结果计 算 NOEC LOEC DB44/T 2340.4 2021 6 Shapiro-Wilk Bartlett s ANOVA Dunnetts NOEC LOEC Jonckheere NOEC LOEC 评价报告 a) b) c) 1) 2) 3) 4) pH d) 1) 2) 3) 21 d VTG mRNA AR mRNA 4) 21 d VTG mRNA AR mRNA NOEC LOEC 5
9、) 90 d 6) 10 诸氏鲻 虾虎 鱼安 乐死 DB44/T 2340.1-2021 10 11 实验室 废弃 物的 处理 SN/T 3592 DB44/T 2340.4 2021 7 A A 附录A （资料 性） 诸氏鲻 虾虎 鱼雌 雄鉴 别方 法 A.1 形态特 征 A.1 表A.1 诸氏鲻 虾虎 鱼雄 鱼和 雌鱼 形态特 征比 较 2 4 2 4 A.2 生殖突 特征 DB44/T 2340.4 2021 8 B B 附录B （资料 性） 诸氏鲻 虾虎 鱼生 殖毒 性评 价原始 记录 表 B.1 试验溶 液配 制记 录表 B.1 表B.1 试验溶 液配 制记 录表 24 h pH p
10、H g/mL mL mL mg/L g mL mL mg/L 1 g mL mL mg/L 2 g mL mL mg/L mL mL mL mg/L mg/L mL mL mL 1 2 1 2 3 B.2 试验观 察和 环境 因子 测定 原始记 录表 B.2 DB44/T 2340.4 2021 9 表B.2 试验观 察和 环境 因子 原始 记录表 a b c d 注： pH DO mg/L L/s A B C 1 A B C 2 A B C A B C 1 mg/L A B C 2 mg/L A B C 3 mg/L A B C 注： “ ” B.3 VTG mRNA 相对 表达 量 （ 荧
11、 光阈 值 Ct ）原 始 记 录表 VTG mRNA Ct B.3 DB44/T 2340.4 2021 10 表B.3 VTG mRNA 相对 表达 量 （ 荧 光阈 值 Ct ）原 始记 录表 1 2 1 mg/L 2 mg/L 3 mg/L -actin A B C VTG A B C B.4 AR mRNA 相 对表 达量 （荧 光阈 值 Ct ）原 始 记 录表 AR mRNA Ct B.4 DB44/T 2340.4 2021 11 表B.4 AR mRNA 相 对表 达量 （荧 光阈 值 Ct ）原 始记 录表 1 2 1 mg/L 2 mg/L 3 mg/L -actin A
12、 B C AR A B C B.5 性腺指 数原 始纪 录表 B.5 DB44/T 2340.4 2021 12 表B.5 性腺指 数原 始纪 录表 B.6 生殖力 原始 记录 表 B.6 DB44/T 2340.4 2021 13 表B.6 生殖力 原始 记录 表 mm mm 1 2 3 4 5 6 7 B.7 孵化率 原始 记录 表 B.7 DB44/T 2340.4 2021 14 表B.7 孵化率 原始 记录 表 0 h pH mg/L 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h pH mg/ L B.8 不投饵 存活 系数 原始 纪录 表 B.8 DB44/T 2340.4
13、2021 15 表B.8 不投饵 存活 系数 原始 纪录 表 d A B C 0 mg/L pH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 mg/L pH DB44/T 2340.4 2021 16 C 附录C （规范 性） VTG mRNA 和AR mRNA 相 对 表达量 测定 方法 C.1 肝脏样 品制 备 50 mg/mL 100 mg/mL TRIzol TRIzol 10% 1 min 2 min C.2 核酸提 取 C.2.1 TRIzol 5 min 12000 g 5 min C.2.2 TRIzol 200 L 15 min 4 120 00 g 15 min C.2.3 TRI
14、zol 0.5 mL 5 min 10 min 4 12000 g 10 min C.2.4 RNA TRIzol 1 mL 75% 4 8000 g 5 min C.2.5 5 min 10 min C.2.6 50 L RNA DEPC C.2.7 OD RNA C.3 反转录 SYBR GREEN C.4 荧光定 量PCR 扩增 C.4.1 扩增引 物 PCR C.1 表C.1 PCR 扩 增引 物序 列 VTG-F:AATGCCATGTTCCTCAGCGA VTG-R:TCAGCTTCTCTGCACCCTTG AR-F: GTGGCGTACAACGAGTCCAG AR-R: TCATC
15、GGAGCAGATCAGGCA -actin ACT-F:GGAAGGTGGACAGAGAAGCC ACT-R:TGCTGACAGGATGCAGAAGG C.4.2 扩增体 系的 配制 DB44/T 2340.4 2021 17 PCR n n 3 3 3+ 3 C.2 表C.2 每个样 品反 应体 系配 置表 SYBR Premix Ex Taq TM 2 10 L 1 PCR Forward Primer(10 M) 0.8 L 0.4 M PCR Reverse Primer(10 M) 0.8 L 0.4 M ROX Reference Dye 50 0.4 L 1 DNA 2 L 1
16、00 ng dd H2O 6 L / Total 20 L / C.4.3 加样 RT-PCR C.3 cDNA 500 g 30 s PCR C.4.4 RT-PCR 扩增 95 30 s 95 5 s 60 34 s 40 60 C.4.5 结果判 定 C.4.5.1 阈值设 定 Ct Ct C.4.5.2 质控标 准 Ct Ct 27 C.4.5.3 结果描 述 2 - Ct VTG mRNA AR mRNA DB44/T 2340.4 2021 18 4 DB44/T 2340.4 2021 * 563 1304 510220 020-84250337 DB44/T 2340.4 2021
