1、ICS 65.020.20 CCS B 05 DB23 黑龙江省地方标准 DB23/T 3168 2022 盐碱土壤嗜盐细菌与古菌资源分离与快速 分类技术规程 2022-05-09 发布 2022-06-08 实施 黑龙江省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB23/T 31682022 I 前 言 本 文件 依据 GB/T 1.1-2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本 文件 由黑 龙江 省农 业农 村厅提出。本 文件 起草 单位：黑
2、龙江 省 农业 科学 院土 壤肥 料 与 环境资 源研 究所。本 文件 主要 起草 人：王爽、孙磊、金 品娇、李 伟群、陈雪 丽、万书 明、刘凯、李一 丹、孙秀 君。DB23/T 31682022 1 盐 碱土壤 嗜盐细菌 与古菌 资源分离 与快速 分类技术 规程 1 范围 本 文件 规定 了盐 碱土 壤嗜 盐细菌 与古 菌资 源分 离与 快速分 类技 术 的 术语 和定 义、原 理、一般 要求、分离方 法和 分类 方法。本 文件 适用 于 盐 碱土 壤中 嗜盐细 菌和 嗜盐 古菌 的分 离 与快 速分类。2 规 范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本
3、 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 19495.2 转基 因产 品检测 实 验室 技术 要求 GB/T 19495.3 转基 因产 品检测 核 酸提 取纯 化方 法 NY/T 1114-2006 微 生物 肥料实 验用 培养 基技 术条 件 NT/T 1377 土壤pH 的测 定 NT/T 1121.16 土壤 检测 第16 部分：土 壤水 溶性 盐 总量的 测定 NY/T 2066-2011 微 生物 肥料生 产菌 株的 鉴别 聚
4、 合酶链 式反 应（PCR）法 NY/T 2321-2013 微 生物 肥料产 品检 验规 程 3 术 语 和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 嗜盐 微 生物（Halophiles）在盐环 境中 生长 旺盛 的一 类喜盐 的微 生物，包 括原 核生物（细 菌和 古菌）和 真核生 物。根据 它们 对氯化钠 的需 求，可分 为轻 度（最 适盐 浓度0.2 mol/L 0.5 mol/L）、中度（最 适盐浓 度0.5 mol/L 2.5 mol/L）和 极端 嗜盐 菌（最 适盐浓 度2.5 mol/L 5.2 mol/L）。3.2 嗜盐细 菌（Halophilic bacteri
5、a）分类学上 属于 细菌域（Bacteria domain），在0.2 mol/L2.5 mol/L 盐浓度 范 围内有最 佳生 长的一类嗜盐 微 生物，主 要为 轻度和 中度 嗜盐 细菌。3.3 嗜盐古菌（Halophilic archaeon）分类学 上 属 于古 菌域（Archaea domain），在含2.5 mol/L5.2 mol/L 盐浓 度范 围 生长 最好 的一 类极端嗜盐 微 生物。3.4 DB23/T 31682022 2 分类（classification）选 择特 定的引 物，采用聚 合酶链 式反应（PCR）法 快 速扩增 嗜盐细 菌和 嗜盐古 菌 分离 株 的16S
6、 rRNA基因，在进 一步 测序 的基 础上进 行16S rRNA 基 因序 列的系 统发 育学 分析 来判 定所属 细菌 或古 菌的 类别。4 原理 16S rRNA 序 列的 系统 发育 学进化 距离 与表 型特 征及 化学分 类数 据 有 非常 好的 相关性，但传 统的 微 生物分类 学方法 比较 繁琐费 时，而PCR 快 速扩增 嗜盐 细 菌和嗜盐 古菌 的16S rRNA 基因 相 对简单 快捷。本方法采用 细菌 和古 菌的 特异 性引物 对分离 菌 株的16S rRNA基因 进行PCR 扩增，对PCR 产物 进行 电泳 检测、纯化和测 序，并 将测 得的 分 离菌株 的16S rR
7、NA 基因 序 列和来 自GenBank 数据库 中 的序列 进行比 较和 系统发育学分 析，来鉴 定其 为细 菌还是 古菌。5 一般 要求 试验操 作人 员应 具备 良好 的微生 物学 知识 积累 和分 子生物 学专 业技 能，操 作 熟练。实 验室 有毒、有害、废 弃物 质的 处理 及个 人安全 防护 应符 合GB/T 19495.2 的要 求。6 分 离方 法 6.1 工具 电子天平（万 分之 一），2 mm 孔 径的筛 子，往复式 电动振 荡机，锥形 瓶，无 菌大试 管，无 菌水，微量可调 移液 器（100 L 1000 L），培 养皿，玻璃刮 铲，接 种环，全自 动高压 灭菌锅，超
8、净工 作台，恒温 培 养箱。6.2 培养 基的 选择 与培 养 基平板 的制 备 6.2.1 嗜盐 细 菌分 离培 养 基 的选 择 营 养琼 脂 培 养基（NA），复 合培 养基（CM），TSA 培 养基，培 养基 成分 及 配制要 点见 附 录 A；R2A培养基 和海 盐琼 脂培 养基（2216E）可于 厂家 购买。6.2.2 嗜盐 古 菌分 离培 养 基 的选 择 稀释 10 倍的 复 合培 养 基（CM），改良 高氏 一号（Cause1）培养 基，稀释 10 倍的 改良 S-G 培 养基，培养基 成分 及配 制 按 附录 A。6.2.3 培 养基 平板 的制 备 培 养基 的配 制按
9、照 NY/T 1114-2006 中 6 的要 求进行。培 养基 平板 的制 备 应符 合 NY/T 2321-2013中5.1.4.1 的要求，对于 培养古 菌的 固体 培养 基要 稍厚一 些，且制 备好 的培 养基应 放置 无菌 密封 袋 中 于4 C 保存。6.3 土壤 样品 的预 处理 及 土壤悬 浮液 的制 备 新鲜土 壤样 品 需 进行 过2 mm 孔径 筛 的 预处 理，按照NY/T 2321-2013 中 5.1.4.2 的要求 用系 列稀 释方法获 得不同 浓度 的 土壤 悬浮 液（菌悬 液）。对于 不能立 即用于 微生 物分离 的新鲜 土样应 暂存 于 4 C冰箱中。DB2
10、3/T 31682022 3 6.4 土壤pH 和 水溶 性盐 总量的 测定 土壤 pH 和 水溶 性盐 总量 的 测定 分 别按 照NT/T 1377 和 NT/T 1121.16 的 规定 进 行。6.5 菌悬 液的 加样 及培 养 6.3 中的 土壤 悬浮 液按 照 NY/T 2321-2013 中 5.1.4.3 的 要求 涂布 在制 备好 的 培养基 平板 上，在30 C 35 C 恒温 静置 培养 箱 中倒置 培养。培 养极 端嗜 盐古菌 的平 板需 要放 在大 封口袋 中，并在 袋中 放 置盛一定 量水 的烧 杯，培养 时间7 d10 d。6.6 纯 菌株 的获 得及 耐盐 性的
11、判 断 采用 平板 反复 划 线分 离法 获 得纯 菌株。挑 取6.5 中 含有 不同 盐浓 度 的 平板 上长出 的单 菌落 划线 至新的、且具 有同 样盐 浓度 的 平板上（确保 每次 划线 都 能有单 菌落 出现，且每 次 都挑取 单菌 落转 移至 下一 个新平板），反 复操 作三次 以上，直至 在同 一平 板上 长出的 菌落 大小、形 状、颜色、质地、光泽 等特 征 一致，则 该菌 株为 可耐 受该 盐度的 纯菌 株。6.7 注意 事项 分离古 菌时 的注 意事 项如 下：a）分离 古菌 的 培养 基中 不能含Difco Bacto-Peptone 蛋白 胨；b）分 离古菌 的培 养基
12、 中 琼脂要 先清 洗后 再加 入，具体的 方法 是：称 取16.5 g琼脂 至蒸 馏水 中，搅拌5 min，放 置30 min 静置 沉降琼 脂，吸去 上清，重 复洗涤 直到 上清 液变 澄清，然后 加水 至50 mL，再搅拌加入 培养 液中；c）高盐 浓度 下琼 脂容 易 沉积，而 且比 普通 的培 养 基更不 容易 去除 气泡，分 离古菌 的培 养基 应在 灭菌后的 较高 温度 下将 琼脂 缓慢摇 匀再 倒平 板。7 分 类方 法 7.1 工具 小型离 心机，微 量可 调移 液器（2.5 L、10 L、100 L、1000 L）及对 应的无 菌 Tip 头，细菌基因 组DNA 提 取试
13、剂盒，超净 工作 台，PCR 仪，电泳仪 及电 泳槽，凝 胶成 像分析 系统。7.2 模板DNA的 提取 及其 浓度测 定 微生物 基因 组DNA 的 提取、纯化 及 其浓 度测 定按 照NY/T 2066-2011 中5.4和GB/T 19495.3 的要 求进行。7.3 引物 的选 择 细菌16S rRNA 通 用引 物 27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。古菌16S rRNA 通 用引 物 21F：5-ATTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3；1540R：5-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG
14、3。7.4 PCR反应 以 同一 待测菌 株 的DNA 为 模 板，分 别用细 菌引 物和古 菌引物 扩增，扩增 出目标 片段，且片段 大小 在1.5 kb 1.6 kb 的为 目标 菌。反应 体系 和反 应参 数 按 附录B 中的B.1和B.2 的规 定 进行，PCR 反应 的质 量控制按照NY/T 2006-2011 中5.2规定 的方 法进 行。DB23/T 31682022 4 7.5 PCR 产物 检测 PCR 扩 增产 物的 电泳 检测 按 照NY/T 2006-2011 中 附录A 中的A.4.4 的要 求。7.6 结果 判定 若待测 菌株的PCR反 应扩 增 出 与目 标片段
15、 的位 置一致，且片 段大小 在1.5 kb1.6 kb，则 判 定待 测菌株PCR 扩 增成 功，检测 方 法按附 录B 中B.3 的规 定进 行。DB23/T 31682022 5 附录A（规范 性）培养基 配方 A.1 营养 琼脂（Nutrient Agar，NA）培 养基 蛋白胨，10.0 g；牛 肉粉，3.0 g；氯化 钠，5.0 g；琼脂，15.0 g，H2O，1000 mL。A.2 复合 培养 基(Complete Medium，CM)酪蛋白(casein)，7.5 g,酵母提 取物（Yeast extract），10 g；柠 檬酸 钠（Trisodium citrate），3
16、g；MgSO4 7H2O，10 g；KCl，2 g；4.98%的FeSO4，1 mL；琼 脂，15.0 g，H2O，1000 mL。A.3 TAS 培养 基 胰蛋白 胨（Tryptone），15 g；大 豆蛋 白胨（Soya peptone），5 g；琼 脂，15.0 g，H2O，1000 mL。A.4 改良 高氏 一号（Cause1）培 养基 可 溶 性 淀粉，20.0 g；KNO3，1.0 g；MgSO4 7H2O，0.5 g；K2HPO4，0.5 g；NaCl，180 g300 g；微量盐，1 mL；琼脂，18 g20 g；H2O，1000 mL。注意：淀粉 用少 量冷 水调 成糊状，加
17、 热溶 解后 再 加入到培 养基 中。A.5 改良S-G 培养 基 酵母提 取物（Yeast extract），10.0 g；酪 蛋白 氨基 酸（Casamino acid），7.5 g；柠檬酸 钠（Trisodium citrate），3.0 g；KCl，2.0 g；MgSO4 7H2O，0.2 g；FeSO4 7H2O，0.036 g；NaCl，180 g300 g；琼脂，18 g20 g；H2O，1000 mL。A.6 培养 基pH 值的 调节 对于嗜 碱性 的嗜 盐细 菌或 古菌，可利 用碳 酸钠 或碳 酸氢钠 来 调 节培 养基 的pH 值，碳 酸钠 溶液 应用 培养基总 体积 中的
18、 一小 部分 水来单 独溶 解，灭菌 后与 培养基 其余 成分 混匀 再倒 平板。不同 碳酸 钠浓 度 对 应的培养 基pH 值如 下 表A.1：表A.1 不 同碳 酸钠 浓度 对 应的培 养基pH值 NaCO3 的质量体积比（w/v）对应培养基 pH 值 0.5%7.5 7.7 0.6%7.87.9 0.7%7.9 8.0 1.0%8.28.5 2.0%9.09.5 5.0%9.510.0 10.0%10.5 11.0 DB23/T 31682022 6 附录B（规范 性）PCR反 应体 系及 扩增 程序 B.1 PCR 反 应体 系 PCR 反应总体积为30 L：10 PCR buffer
19、3.0 L；dNTP（25 mM），2.5 L；正向引物，1.5L；反 向引 物，1.5 L；10 ng 50 ng 的DNA模板，1.0 L；IU Taq DNA 聚 合酶，0.3 L；加 水至总体积30 L。B.2 PCR 扩 增程 序 预变性，94 C 5 min；扩 增循环，94 C 30 s；55 C 30 s，72 C 90 s；32个 循环；72 C 10 min。其中扩 增时 的退 火温 度，根据不 同情 况有 所变 化。B.3 PCR 产 物的 电泳 检测 l%琼脂 糖凝胶 电泳，PCR 产 物上样 量为5 L，电泳缓 冲液使 用0.5 TBE，加适 量EB（或Gel-Res、SYBR Green）核酸 染料，120 v 电压20 min 30 min。紫外灯 下观 察结 果，PCR 产 物大小 约1.5 kb 1.6 kb的电泳 条带。B.4 16S rRNA 基因 序列 分 析 B.3 中 获得 的PCR 产物 进行序 列测 定，
