1、ICS 65. 120 B 46 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 838 1.3-2005 饲料中林可霉素的测定Determination of lincomycin in feed 2005-09-05发布2006-02-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局也世中国国家标准化管理委员会a叩G/T 8381.3-2005 前言本标准参考了美国公职分析化学家协会(AOAC)(公定分析方法)978.31饲料中的林可霉素微生物学方法和国内外有关林可霉素生产、检验等资料，根据我国饲料工业的实际情况制定。本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业标准
2、化技术委员会归口。本标准由辽宁省兽药饲料监察所负责起草，吉林省兽药监察所和国家饲料监督检验测试中心(北京)参加起草。本标准主要起草人:陈莹莹、曹东、董永亮、刘雪红、苗畅海、肖勇、战石、李广生、刘同民、杨曙明。GB/T 838 1. 3-2005 饲料中林可霉素的测定1 范围本标准规定了饲料中林可霉素的测定方法。本标准适用于浓缩饲料、配合饲料中林可霉素的鉴别和含量测定。采用本方法鉴别林可霉素的最小含采用本方法测定林可霉素7附限兰工?料中R义。林可霉素效价单位。2 规范性引用文件3.1 用微生与生物活4 原理5 试剂和溶液5.1 林可霉素标准品:符合5. 2 藤黄微球菌(Micrococcus5.
3、 3 甲醇。5.4 正己皖。5.5 二氯甲烧。5.6 硅胶G，薄层层析用。5. 7腆。5.8 盐酸溶液:取盐酸9mL，加水至1000 mL，棍匀。5.9盐酸甲醇，1十1。5. 10 氨溶液:取浓氨溶液50mL，加水至100mL，混匀。5. 11 氨溶液:取被氨溶液5mL，加水至100mL，混匀。的引用文件，其随后所有准达成协议的各方研究准。活性部分的质量用。两种展开剂展开，量。G/T 8381.3-2005 5. 12 展开剂1，丁酣-丙酣-水，9.3+2.6+L5. 13 展开剂2，三氯甲:皖-甲醇-浓氨溶液，1+1+l，昆合，振摇，静置至上下两层均澄清，分取下层混合液备用。5. 14 林可
4、霉素标准溶液:取林可霉素标准品50mg，加甲醇2mL使溶解，用二氯甲烧稀释至浓度为1 mg/mL。当天配制。供鉴别用。5.15 林可霉素标准储备液:称取50mg林可霉素标准品，精确至0.1mg，用水溶解并稀释成约含1 000 u/mL的溶液。在2.C10.C可保存7天。供含量测定用。6 仪器及设备6. 1 分析天平，感量0.0001 g。6.2 天平，感量0.01g。6.3。振荡器。6.4 离心机。6.5 旋转蒸发器。6.6 超声波发生器。6. 7 旋涡式微型混合器。6.8 电热恒温水浴锅。6.9 注射器，全玻璃，5mL，配有俨针头。6. 10 浓缩瓶，容量10mL，具塞，底部具0.2mL刻度
5、尾管。6. 11 玻璃板，规格20cmX 10 cm. 6. 12 展开槽，立式，双槽，规格10cmX5 cmX20 cm。6. 13 平底双碟，直径约90mm，高16mm17 mm;符合中华人民共和国兽药典)2000年版一部的要求。6. 14 不锈钢小管，高10.0mm :J: O. 1 mm，外径8.0mm士0.1mm，内径6.0mm土0.1mm;符合中华人民共和国兽药典)2000年版一部的要求。6.15 恒温培养箱。6.16 高压灭菌锅。6. 17 游标卡尺(精度0.02mm)或抑菌圈测量仪。7 试样的制备将按GB/T14699. 1取得的样品，四分法缩分，取约200g，经粉碎，全部过1
6、mm孔筛，混匀，装入磨口瓶中备用。8 鉴别8. 1 净化8. 1. 1 提取称取20g试样(7)，准确到0.01g，置150mL具塞锥形瓶中，加入50mL甲醇(5.3)，振摇30min, 过滤，取25mL滤液，在旋转蒸发器(6.5)上于50.C减压蒸发至约5mL。8.1.2 转移将浓缩液转移到10mL离心管中，用2mL甲醇分次冲洗蒸发瓶，洗液并入离心管，置60.C水浴(6.8)中蒸干。加0.01mol/L盐酸溶液(5.8)2mL，超声1min，使林可霉素榕解，溶液转移到另一离心管，再向残渣中加0.01mol/L盐酸溶液0.5mL，超声308. GB/T 8381.3-2005 8. 1.3 洗
7、涤合并两次酸搭液(8.1.2)，加入3mL正己皖(5.的，于微型混合器(6.7)上混合30s，弃去上层正己皖，用7mL二氯甲皖(5.5)分三次洗涤酸提取液(3、2、2mL)，每次?昆合30s，用注射器(6.9)吸去下层二氯甲烧。如果出现乳化现象，可于3000r/min离心5min破除乳化，使溶液分层。8.2 试样溶液的制备用氨溶液(5.11)调节酸提取液(8.1. 3)至pH10，用7mL二氯甲皖分三次(3、2、2mL)提取溶液中的林可霉素，每次混合1min，吸出下层二氯甲烧提取液，合并到浓缩瓶(6.10)中，在30.C水浴中蒸干。放冷至室温后加入0.2mL二氯甲皖溶解残渣，留做薄层层析用。当
8、天使用。8.3 测定8.3. 1 薄层极的制备取8g硅胶G(5.6)，加水约24mL，研磨2min至呈粘稠状，铺成三块薄层板(6.11)，置室温干燥后，于105.C活化1h，贮干燥器中备用。一周内使用。8.3.2 点样取两块薄层板(8.3.1)，在距下端2cm处作为基线点样。每块板各点三个样点:50L林可霉素标准溶液(5.14)、25L试样榕液(8.2)和25L林可霉素标准榕液、50L试样溶液，各点间距离应不小于1cm。8.3.3 展开在两个展开槽内分别倒入10mL展开剂1(5.12)和10mL展开剂2(5.13)，将点好样的两块薄层板分别置装有展开剂的展开槽中(不浸入展开剂中)，预饱和2h，
9、再浸入展开剂中展开15cm，取出，通风挥干。8.3.4 显影将展开后的薄层板放置在充满腆(5.7)蒸气的密闭容器内，注意观察，薄层板上的林可霉素标准搭液斑点逐渐显现直至清晰可见，取出薄层板立即观察。8.4 观察与判定比较薄层板上各斑点的位置以及颜色，判定方法如下:一一在两块薄层板上，试样溶液在与标准溶液斑点对应处均无斑点出现，且棍合加样点的斑点颜色比标准榕液斑点浅，判定试样中林可霉素阴性;一一两块带层板中，其中一块板上的试样榕液在与标准榕液斑点对应处无斑点出现，而另一块板出现斑点，判定试样中林可霉素阴性;在两块薄层板上，如果试样溶液在与标准榕液斑点对应处均出现斑点，混合加样点只显现一个主斑点(
10、与标准品溶液中最大的、颜色最重的斑点对应处)且所显现的斑点与标准溶液斑点的位置及颜色相同，可能判定林可霉素阳性，继续以下含量测定。9 含量测定9. 1 菌悬液的制备取藤黄微球菌(5.2)的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基(第A.4章)的培养瓶中，在26.C27.C培养24h，或采用适当方法制备的菌斜面。用0.9%灭菌氯化铀溶液(第A.1章)将菌苔洗下，置4.C冰箱保存(不宜超过两周)。9.2 双蝶的制备取平板培养基(第A.5章)加热融化，冷却至50.C:I:1.C，加入适量菌悬液(9.1) (以参考浓度标准工作溶液所至抑菌圈直径在18.5mm:l: 2 mm为宜)，必要时，每100
11、mL培养基中可加人50%葡萄糖溶液(第A.3章)2mL，摇匀。每1个双碟(6.13)加入10mL，均匀摊布，放置水平台上冷却，待培养基凝固后，将双碟倒置于4.C冷藏1h以上。临用前取出，在每1个双碟内半径为2.8cm圆周上等距离放置3 GB/T 8381.3-2005 6个不锈钢小管(6.14)。9. 3 标准曲线的制备9.3.1 标准工作溶液量取林可霉素标准储备液(5.1日，用磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释使成O.15 u/mL、0.30u/mL、0.60 u/mL、1.20 u/mL、2.40u/mL浓度的标准工作溶液。以0.60u/mL为参考浓度标准工作溶液。9.3.2 培养取当天制备好
12、的双碟(9.2)平均分为5组，标准工作榕液(9.3.1)每一浓度为1组。每一个双碟的6个不锈钢小管中，间位的3个滴加参考浓度标准工作溶液，另外3个滴加该组标准工作溶液，每组滴9.4.1 提取称取15g 50 mL，振摇309.4.2 净化准确量取离函、甲烧，旋摇30s , 用氨溶液(5.1 助确认)，加入10m 9. 4. 3 试样溶液声不少于2min，使残渣中2.40 u/mL之间)制成试样洛-9. 5 测定取与标准曲线同时制备的至少3个班和参考浓度标准工作榕液，与标准曲线同时操作和培养。10 判定与结果计算10. 1 判定一一试样溶液不产生抑菌圈，判定林可霉素阴性;一一试样溶液产生抑菌圈，
13、判定林可霉素阳性并计算含量。10.2 结果计算，分别计算平均值，再计算所有双. ( 1 ) 01/11盐酸-甲醇(5.的用回归方程求出标准工作榕液参考浓度对应的抑菌圈数值作为修正值，按式(1)校正试样榕液抑菌4 GB/T 8381.3一2005圈读数的平均值，再用回归方程求出试样榕液中林可霉素的实测浓度(c)。试样中林可霉素的含量按式(2)计算:式中zw=三兰旦X1000 1 W一一试样中林可霉素的含量，单位为林可霉素效价单位每千克(u/kg);C一一试样榕液中林可霉素的实测浓度，单位为林可霉素效价单位每毫升(u/mL); n一一试样的稀释倍数;m一一试样质量，单位为克(g)。测定结果用平行测
14、定的算术平均值表示，保留至整数位。11 重复性同一操作者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于20%。 ( 2 ) 5 GB/T 8381.3-2005 附录A(规范性附录)溶液及培养基的配置A.1 0.9%灭菌氟化铀溶液取氯化铀9g，加水使成1000 mL，滤过，分装，1l5.C灭菌30min。A.2 磷酸盐缓冲液(pH7.8)取磷酸氢二饵5.59g与磷酸二氢梆0.41g，加水便成1000 mL，滤过，分装，1l5.C灭菌30min。A.3 50%葡萄糖溶班取葡萄糖50g，加水使成100mL，滤过，分装，100.C灭菌20min. A.4 营养琼脂培养基陈10g 氧化铀5 g 琼
15、脂15 g20 g 肉浸液1000 mL 除琼脂外，tl昆合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高O.20. 4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.27. 4，分装，115.C灭菌30min，趁热斜放使凝固成斜面。A.5 平板培养基陈6 g 牛肉漫出粉1. 5g 酵母浸出粉6 g 葡萄糖1 g 琼脂15 g20 g 水1 000 mL 除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高O.20. 4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.8-8.0，分装，1l5.C灭菌30min。培养基可以采用相耐成分的抗生素微生物检定培养基11(中
16、华人民共和国兽药典)2000年版一部)的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌。6 mCON-m.忘的眨阁。华人民共和国家标准饲料中林可霉素的测定GB/T 838 1. 3-2005 国白峰中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张o.75 字数12千字2006年1月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2006年1月第一版 定价10.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-26925 838 1. 3-2005
