1、ICS 67050X 04 囝雷中华人民共和国国家标准GBT 22946-2008蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素、交沙霉素残留量的测定 液相色谱一串联质谱法Determination of lincomycin，erythromycin，tiimicosin，tylosin，spiramycin，clindamycin，kitasamycin and josamycin residues in royal jelly andlyophilized royal jelly powder-LC_。MS-MS method2008-12-31
2、发布 2009-05-0 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局省士中国国家标准化管理委员会及仲刚 吾本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王飞、王海洋、曹彦忠、贾光群、张进杰、石玉秋、庞国芳。GBT 22946-2008蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素、交沙霉素残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22946-20081范围本标准规定了蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉
3、他霉素和交沙霉素残留量的液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素和交沙霉素残留量的测定。本标准的方法检出限：蜂王浆中的林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素、交沙霉素均为20 pgkg；蜂王浆冻干粉中的林可霉素、红霉素、泰乐菌素、克林霉素、交沙霉素均为20 pgkg，替米考星、螺旋霉素、吉他霉素均为50#gkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标
4、准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第l部分：总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 5725 2：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰
5、乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素和交沙霉素的残留用Tris提取液提取，提取液经Oasis HLB固相萃取柱”净化，甲醇洗脱，洗脱液浓缩定容后，供液相色谱一串联质谱法测定。外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯。41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙酸铵。44乙腈：色谱纯。45盐酸。1) Oasis HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。1GBT 22946-200846三羟甲基氨基甲烷(Tris)：C。H。NO。47氯化钙(C
6、aCl：2HzO)。48 甲醇溶液(2+3)：量取400 mL甲醇(42)与600 mL水混合。49 001 molL乙酸铵溶液：077 g乙酸铵(43)溶解于水中，定容于1 000 mL容量瓶中。410定容液：0Ol molL乙酸铵溶液(49)+乙腈(44)(17+3)。411 Tris提取液：称取120 g三羟甲基氨基甲烷(46)和735 g氯化钙(47)溶解于水中，用盐酸(45)调节pH值为9，定容至1 000mL。412标准物质：林可霉素(CAS：7179499)、红霉素(CAS：59319721)、替米考星(CAS：10805054一o)、泰乐菌素(CAS：74610552)、螺旋霉
7、素(CAS：8025818)、克林霉素(CAS：21462395)、吉他霉素(cAS：139221 8)和交沙霉素(cAs：16846245)纯度95。413标准储备溶液I：10 mgmL。分别准确称取每种标准物质(412)适量，分别放人相对应的10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀。4保存。414标准储备溶液：100 ggmL。分别吸取01 mL各标准储备溶液(413)，分别放入相对应的10 raL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。4保存。415标准工作溶液：20 tsgmL。分别吸取20 mL标准储备溶液(414)，分别放人相对应的10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。416 Oasi
8、s HLB固相萃取柱或相当者：500 mg，6 mL。使用前，依次用10 mL甲醇和10 mL水活化，在抽真空前的各步骤中，都保持柱体湿润。417滤膜：02,um。5仪器51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。52天平：感量001 g，0000 1 g。53固相萃取装置。54氮气浓缩仪。55具塞聚丙烯离心管：50 mL。56离心机。57超声波清洗仪。58 pH计。59振荡器。6试样制备与保存61试样的制备从全部样品中取出有代表性样品约200 g，充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封后作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。62试样的
9、保存将蜂王浆试样于18保存。蜂王浆冻干粉试样密封保存，防止吸潮。7测定步骤71提取称取2 g蜂王浆试样(蜂王浆冻干粉取1 g)，精确至001 g，置于50 mL离心管(55)中，加入100 mLTris提取液(411)，于振荡器上剧烈振荡10 rain。以18 000 g离心力离心10 rain，取上清液以小于10 mLmin的流速通过Oasis HLB固相萃取柱(416)。再加入100 mL Tris提取液(411)，2GBT 22946-2008于振荡器上剧烈振荡10 rain。以18 000 g离心力离心i0 rain，取上清液以小于10 mLmin的流速通过Oasis HLB固相萃取柱
10、。72净化待样液全部流出后，依次用10 mL水和10 mL甲醇溶液(48)洗柱，弃去全部流出液，将固相萃取柱用真空泵减压抽干1 h。再用10 mL甲醇(42)洗脱于15 mL氮吹管中，用氮气浓缩仪于50水浴中吹至近干，准确加入10mL定容液(410)后，于超声波清洗仪中溶解残渣。过02 tam滤膜(417)后，供液相色谱一串联质谱仪测定。73基质标准混合工作溶液的制备731蜂王浆用基质标准混合工作溶液的制备：分别吸取10 pL、20 pL、50 pL、25 pL的林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素标准工作溶液(415)，依次加入相对应的阴性样品中，按7
11、1、72步骤制备林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素分别为20 ngmL、50 ngmL、100 ngmL、500 ngmL四个浓度水平的系列基质标准混合工作溶液。732蜂王浆冻干粉用基质标准混合工作溶液的制备：分别吸取10IL、20 pL、50止、25pL林可霉素、红霉素、克林霉素、泰乐菌素、交沙霉素标准工作溶液(415)和25 pL、50 pL、100 pL、259L的替米考星、螺旋霉素、吉他霉素标准工作溶液(415)，依次加入相对应的阴性样品中，按71、72步骤制备林可霉素、红霉素、克林霉素、泰乐菌素、交沙霉素分别为20 ngmL、40 ngmL、
12、100 ngmL、500 ngmL和替米考星、螺旋霉素、吉他霉素分别为50 ngmL、100 ngmL、200 ngmL 500 ngmL四个浓度水平的系列基质标准混合工作溶液。74测定条件741液相色谱参考条件a) 色谱柱：Atlantis C18，3 pm，150 mm21 mm(内径)或相当者；b)流动相：A：乙腈，B：01甲酸水溶液，C：甲醇。梯度洗脱条件见表1；c)流速：02 mLmin；d)柱温：30；e)进样量：20 pL。表1梯度洗脱条件时间min A B C000 900 50 505OO 50 900 50900 50 900 50910 90 0 50 50170 90
13、0 50 50742质谱参考条件a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测；d)电喷雾电压：5 500 V；e)雾化气压力：024 MPa；f)辅助气流速：04 Lming)离子源温度：550；h)碰撞室出口电压：20 VGBT 22946-2008)定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压：见表2。表2林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压化舍物中文名称 化合物英文名称 定性离子对(mz) 定量离子对(mz) 碰撞气能量v 去簇电压v407126 37 50林可霉素4071
14、26407359 24 50734158 42 50红霉素erythromycin 734188734576 28 S0869174 62 90替米考星86974869132 70 9091G174 54 80泰乐菌素918174916145 55 8042S126 45 53壳林霉素 clindam,cin 425126425377 28 53843142 48 60螺旋霉素splramYcm 843142843174 50 60772215 43 70吉他霉素 772z15772109 42 70828174 45 80交沙霉素 828174828109 45 8075液相色谱一串联质谱测
15、定751定性测定被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在25之内；且样品中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准工作溶液中被测物的各定性离子相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K1。允许最大偏差 士20 土25 土30 so752定量测定在仪器最佳工作条件下，以基质标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用基质标准工作溶液的工作曲线对样品进行定量，应使样品溶
16、液中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的响应值在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的参考保留时间见表4。4GBT 22946-2008表4林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素参考保留时间化合物名称 保留时间rain林可霉素 696红霉素 806替米考星 836泰乐菌素 848克林霉素 851螺旋霉素 867吉他霉素 883交沙霉素 914林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的标准物质
17、多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1、图A2、图A3、图A4、图A5、图A6、图A7、图A8。林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。76平行试验按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。77空白试验不称取样品，其余均按步骤71和72进行。8结果计算林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的残留量按式(1)计算：xc筹獬 m 1 UUU式中：x试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克(mgkg)；c从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(pgmL)
18、V试样溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素添加浓度范围及重复性方程见表5。5GBT 22946-2008表5林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化台物
19、名称 掭加浓度范围 重复性限r 再现性R林可霉素 20500 Ig r=o939 2k1 030 4 lgR一0874 1 lgm 0518 2红霉素 20500 lg r一0797 419m一0981 1 lgR一1050 6 lg0 577 5替米考星 20500 19 r一1031 8 lgm-0985 9 】gR=0985 3 lg0 556 1泰乐菌素 20500 lg r1056 9 lgm一0999 3 lgR-0851 3 lg m-u0 561 6克林霉索 20500 lg r一1，079 8lgnl 149 5 igR一0885 4 lgm 0414 6螺旋霉素 20500
20、 Ig r一0912 5 Ig0 975 1 lg R一1043 2 lgm 0591 7吉他霉素 20500 lg r一1100 i Igm一1025 0 19R一1145 3 lg0 766 5交沙霉素 20500 lg r=1，438 9lgnl 418 5 lgR=1122 7Igm一0696 5注：仇为两次测定值的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉索和交沙霉素的添加浓度范围及再现性方程见表5。附录
21、A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图GBT 22946-2008林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的标准物质多反应监测(MRM)色谱图分别见图A1、图A2、图A3、图A4、图A5、图A6、图A7、图A8。响应值1 00c5响应值图A1 林可霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图响应值6 00e45 00e44 00e43 00e42 00c41 00e4图A2红霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图图A3替米考星标准物质多反应监测(MRM)色谱图图A4泰乐菌素标准物质多反应监测(MRM)色谱图JlI，11，L81触州州州响1&iGBT 2
22、2946-20088响应值1 00e5响应值5 00e3400e33OOe3图A5克林霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图图A6螺旋霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图响应值4 OOe4】00e4图A7吉他霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图图A8 交沙霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图uL8一。l。，。L8唪654321；。L9J附录B(资料性附录)回 收 率GBT 22946-2008本方法中，林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B1。表B1林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据化舍物名称 添加浓度(#gkg) 平均回收率20 94950 949林可霉素100 1019200 88820 97150 98 o红霉素10o 96620 o 94120 94250 98 7替米考星10 0 92 7200 85 820 8965o 868泰乐菌素loo 966200 91 92o 98 450 981克林霉素10o 937200 9052o 8765o 931螺旋霉素100 95 820 o 92220 8795o 800吉他霉素100 99620o 86420 89450 918交沙霉素100 942200 942
