1、ICS 67050X 04 缉雪,11华人民共和国国家标准GBT 2294 12008蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of lincomycin，erythromycin，spiramycin，tilmicosin，tylosin，josamycin，kitasamycin，oleandomycin residues in honeyLCMSMS method2008-12-31发布 20090501实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局学者中国国家标准化管理委员会仅111刖 舌本
2、标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：曹彦忠、张艳梅、贾光群、张进杰、石玉秋、庞国芳。GBT 229412008蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 2294120081范围本标准规定了蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素残留量液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素残留量的
3、测定。本标准的方法检出限均为20tgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 637912004，ISO 5725 i：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 20
4、04，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理蜂蜜中残留的林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液(pH一9)提取，过滤后，经Oasis HLB固相萃取柱1或相当的固相萃取柱净化，用甲醇洗脱并蒸干，残渣用乙腈一001 molL乙酸铵溶液溶解，过02 pm滤膜后，样品溶液供液相色谱一串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44三羟甲基氨基甲烷(
5、Tris)：优级纯。45氯化钙(CaClz2HzO)：优级纯。46乙酸铵：优级纯。1)Oasis HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。1GBT 2294 1200847盐酸：优级纯。48淋洗液：甲醇溶液(2+3)。量取40 mL甲醇(42)与60 mL水混合。49 001 molL乙酸铵溶液：称取077 g乙酸铵(46)溶于1 000 mL水中。410 02 molL三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液：称取120 g三羟甲基氨基甲烷(44)和735 g氯化钙(4
6、5)，放入1 000 mL烧杯中，加入800 mL水溶解，用盐酸(47)调至pH值为90，再用水定容至1 000 mL。411定容液：乙腈一001 molL乙酸铵溶液(3+17)。量取15 mL乙腈(43)和85 mL乙酸铵溶液(49)混合均匀。412标准物质：林可霉素(CAS：71 79499)、红霉素(cAs：59319721)、螺旋霉素(CAS：802581 8)、替米考星(CAS：108050 540)、泰乐菌素(CAS：74610552)、交沙霉素(CAS：1684624 5)、吉他霉素(CAS：1392 2卜8)、竹桃霉素(CAS：7060744)，纯度99。413 01 mgmL
7、标准储备溶液：准确称取适量的各标准物质(412)，用甲醇分别配成01 mgmL的标准储备溶液。该溶液在4保存。414 10gmL混合标准工作溶液：吸取各标准储备溶液(413)01 mL移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液在4保存。415内标物质：罗红霉素(CAS：80214831)、克林霉素(CAS：21462395)，纯度99。416 01 mgmL罗红霉素、克林霉素内标储备溶液：准确称取适量的罗红霉索、克林霉素标准物质(415)，用甲醇配成01 mgmL的内标储备溶液。该溶液在4保存。417 10 f*gmL混合内标工作溶液：分别吸取罗红霉素和克林霉素内标储备溶液(416)01
8、 mL移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液在4保存。418基质标准工作溶液：吸取不同体积混合标准工作溶液(414)和20 pL混合内标工作溶液(417)，用空白样品提取液配成20 ngmL、50 ngmL、100 ngmL、200 ngmL、500 ngmL不同浓度的基质标准工作溶液。当天配制。419 Oasis HLB固相萃取柱或相当者：200 mg，6 mL。使用前依次用5 mL甲醇(42)和10 mL水活化，保持柱体湿润。420滤膜：02 pm。5仪器51液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子源。52分析天平：感量01 mg和001 g。53氮气浓缩仪。54液体混匀器。55贮液器
9、：50 mL。56真空泵：最大负压80 kPa。57固相萃取装置。58吹于管：10 mL。6试样的制备与保存61试样的制备对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。分出05妇作为试样。制备好的试样置于样品瓶2中，密封，并做上标记。62试样保存将试样于常温下保存。7测定步骤GBT 22941200871提取称取2 g试样，精确至001 g。置于150 mL三角瓶中，加入20 pL混合内标工作溶液(417)，加入25 mL Tris缓冲溶液(410)，于液体混匀器(54)上快速混匀l min，使试样完全溶解
10、。72净化将塞有玻璃棉的玻璃贮液器(55)连到Oasis HLB固相萃取柱(419)上，把样液倒入玻璃贮液器中，调节流速小于3 mLmin，待样液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL淋洗液(48)洗柱，弃去全部流出液。减压抽干20 rain，然后用5 mL甲醇(42)洗脱，收集洗脱液于10 mL吹干管(58)中。用氮气浓缩仪(53)于50吹干。准确加入10 mL定容液(411)溶解残渣，过02 tim滤膜后，供液相色谱一串联质谱仪测定。按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的样品空白提取液。73测定条件731液相色谱参考条件a)色谱柱：Atlantis C”3 pm，150 mmX
11、2 1 rnm(内径)或相当者；b)流速：02 mLmin；c)柱温：30；d)进样量：20 pL；e) 流动相：A：乙腈，B：01甲酸溶液，C：甲醇。梯度洗脱条件见表1。表1梯度洗脱条件时间rain A t3 C000 900 50 505 00 50 900 509 00 5 0 900 509 10 900 50 50170 900 50 50732质谱参考条件a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测；d)电喷雾电压：5 500 V；e)雾化气压力：0069 MPa；f)气帘气压力：0069 MPa；g)辅助气流速：7 Lmin；h)离子源温度：450
12、；i)定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表2。3GBT 2294 12008表2定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压定性离子对 定量离子对 碰撞气能量 去簇电压化合物中文名称 化合物英文名称(mz) (rez) V V407126 37 50林可霉素407126407359 24 50688158 42 30红霉素erythromycin 6881586sss44 23 30734158 42 50螺旋霉素splramycm 7345873457628 50869174 62 90替米考星 tilmicosin 869174869132 70 90916；74 54 80泰
13、乐菌素 91674916145 55 80425126 45 53交沙霉素 42S126425377 25 53843142 48 60吉他霉素8431428431 74 50 60772215 42 70竹桃霉素 oleandomycin 77221577210970 7074液相色谱一串联质谱测定741定性测定被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在25之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。表3定性确
14、证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10允许最大偏差 土20 士25 土30 50742定量测定在仪器的最佳工作条件下，用基质标准工作溶液(418)分别进样，以各标准溶液中被测组分峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，以各标准溶液被测组分浓度与内标物浓度的比值为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量。样品溶液中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素的参考
15、保留时间见表4。林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素的标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。本方法的添加平均回收率数据参见附录B中的表B l。表4林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉参考保留时间化合物名称 保留时间rain林可霉素 761红霉素 996表4(续)GBT 2294卜一2008化合物名称 保留时间rain螺旋霉素 891替米考星 956泰乐菌素 1004交沙霉索 1133吉他霉素 1062竹桃霉素 97275平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验除不称取试样外，均按
16、上述步骤进行。8结果计算蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素残留量的测定结果按式(1)计算：x一会三象筹揣式中：x试样中被测物残留量，单位为微克每千克(tLgkg)；o 基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A试样溶液中被测物的色谱峰面积；A。 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；Cl试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A。：基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；Ai 试样溶液中内标物的色谱峰面积；V样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m 试
17、样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素添加浓度范围及重复性方程见表5。5GBT 229412008表5添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R林可霉素 2o50o lg r一1051 o lgm一1265 o lgR一
18、0865 6lgm 0552 0红霉素 20500 lgRl 033 5lg1 225 l lgR=1110 8lgm一09901螺旋霉素 2 o50o lg r一0 870 2lgm一110I 4 lgR一1102 8lgnl 01 6 0替米考星 2050 0 培rt，093 4 lgmi349 1 】gR=0962 1 lgm0 807 0泰乐菌素 20500 lg r=0970 7 lgm 1146 3 lgR-0815 7 lg m_u0 680 1交沙霉素 20-50，0 19，一0，937 919m一1177 0 lgR-0857 1】g0 756 5吉他霉素 2050 0 lg
19、 r一1020 8lg1 338 6 lgR一0959 8190 900 4竹桃霉索 2 0500 19 r=0975 7 lgm一1274 2 19R一0886 3 lgm 0584 9注：m为两次钡5定值的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素的添加浓度范围及再现性方程见表5。GBT 229412008附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考
20、星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图见图A1。响：应9值；6i3：林可霉素螺旋霉素11 97 响应值泰乐菌素吉他霉素红霉素替米考星ml“交沙霉素10 70、ml”竹桃霉素舟91I图A1 标准物质多反应监测(MRM)色谱图1lll8642响应值87654321响应值111118642响应值。GBT 229412008附录B(资料性附录)回收率本方法中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素添加浓度及平均回收率的试验数据见表B1。表B1林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素添加浓度及平
21、均回收率的试验数据化合物名称 添加浓度(pgkg) 平均回收率2o 100050 994林可霉素100 95750 o 9492o 85750 862红霉素10o 87750 o 90 820 83950 837螺旋霉素10 o 82850o 87720 8495 o 876替米考星100 904500 89320 8645o 844泰乐菌素10o 867500 8882o 80650 860交沙霉素100 77750o 8402o 79350 834吉他霉素100 79350o 830表B1(续)GBT 229412008化合物名称 添加浓度(pgkg) 平均回收率20 83050 83 8竹桃霉素100 846500 8309
