1、ICS 67050X 04 a图中华人民共和国国家标准GBT 22988-2008牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的测定 液相色谱一串联质谱法Determination of spiramycin，pirlimycin，oleandomycin，tilmicosin，erythromycin and tylosin residues in milk and milk powderLCMSMS method200812-31发布 20090501实施宰瞀徽鬻瓣警雠瞥星发布中国国家标准化管理委员会议19刖 置GBT 22988-2008本标准的附录A、附录
2、B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭春海、艾连峰、段文仲、陈瑞春、马育松、窦彩云、刘宝圣、张增利、庞国芳。牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的测定 液相色谱一串联质谱法GBT 22988-20081范围本标准规定了牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的高效液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的测
3、定和确证。本标准的方法检出限：牛奶为1 pgkg，奶粉为8 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 637912004，ISO 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法
4、(GBT 63792 2004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987。MOD)3原理用乙腈提取试样中的分析物，固相萃取柱净化，高效液相色谱一串联质谱测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41乙腈，液相色谱纯。42甲醇，液相色谱纯。43乙酸，液相色谱纯。44甲酸铵，液相色谱纯。45磷酸氢二钠。46氢氧化钠。47甲醇一水溶液(3+7)：300 mL甲醇与700 mL水混合。48 5 molL氢氧化钠溶液：称取20 g氢氧化钠，用水溶解，定
5、容至i00 mL。49 01 molL磷酸盐缓冲溶液：6 g磷酸氢二钠(45)溶解于450 mL水中，用氢氧化钠(48)溶液调节pH一8，加水至500 mL，使用前配制。410 01 molL甲酸铵溶液：063 g甲酸铵(44)2u水溶解至1 000 mL。411标准品：螺旋霉素(spiramycin，CAS：8025818)、吡利霉素(pirlimycin，CAS：79548735)、竹桃霉素(oleandomycin，CAS：7060744)、替米卡星(tilmicosin，CAS：10805054一o)、红霉素(erythromycin，1GBT 22988-2008CAS：114 07
6、8)、泰乐菌素(tylosin，CAS：140169 o)，纯度均大于等于98。412标准储备液：分别精确称取适量标准品，用甲醇配制成100 pgmL的标准储备液。413混合标准中间工作液：取标准储备液(412)各1 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成混合标准工作液，浓度为1 pgmL。414滤膜：045 tLm。415 HLB固相萃取柱”或相当者：500 mg，6 mL。使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL磷酸盐缓冲溶液(49)预处理。5仪器和设备51 高效液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESD。52离心机：转速大于3 000 rrain。53旋涡混合器。
7、54旋转蒸发仪。55氮吹仪。56固相萃取装置。6试样的制备与保存61牛奶取均匀样品约250 g装入洁净容器作为试样，密封置4下保存，并标明标记。62奶粉取均匀样品约250 g装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。7测定步骤71提取711牛奶称取4 g，准确至001 g，牛奶样品于50 mL具塞离心管中，加人20 mL乙腈振荡提取2 rain后，3 000 rmin离心10 rain，移取上清液过滤至鸡心瓶中。再用10 mL乙腈重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。712奶粉称取05 g，准确至001 g，奶粉样品，加入4mL水于50mL具塞离心管中，混匀。加入20mL乙腈振荡提取2 min
8、后，3 000 rrain离心10 rain，移取上清液过滤至鸡心瓶中，再用10 mL乙腈重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。72净化将提取液于45下旋转蒸发至约4mL左右，加入2mL磷酸盐缓冲液(49)，混匀后，转移到已条件化的HLB固相萃取柱(415)上，再用2 mL磷酸盐缓冲液洗涤鸡心瓶两次，洗液一并转移到柱上，以小于2 mLmin流速滴下。接着依次用3 mL水和2 mL甲醇一水溶液(47)淋洗并抽干柱，最后用6 mL乙腈洗脱并收集于10 mL带刻度的玻璃管中(此过程流速小于2 mLmin)。洗脱液在45水浴上氮气吹至约l mL，用甲酸胺溶液(410)定容至2 mL，涡旋混合后，过0
9、45 pm滤膜供HPLC-MS-MS分析。73空白基质溶液的制备将取牛奶阴性样品4 g，奶粉阴性样品05 g，精确到001 g，按71和7，2操作。1)HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的教果，则可使用这些等效产品。74测定条件741液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：苯基柱，5 pm，150 mm21 ram(内径)或相当者b)色谱柱温度：30；c) 进样量：15 pL；d) 流动相梯度及流速见表l。表1 液相色谱梯度洗脱条件GBT 22988-2008时间rain 流速(#Lr
10、en) 01甲酸水溶液“ 甲醇O00 200 80 20600 200 20 80800 200 20 80801 200 80 2010 0 200 80 20742质谱参考条件质谱参考条件如下：a) 离子化模式：电喷雾正离子模式(ESI+)；b)质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；c)鞘气压力：104 kPa；d)辅助气压力：138 kPa；e)正离子模式电喷雾电压(Is)：4 000 V；f)毛细管温度：350；g) 源内诱导解离电压：10 V；h)Ql为07，Q3为07；1)碰撞气：高纯氩气；j)碰撞气压力：0z Pa；k) 参考保留时间、监测离子对和裂解能量见表2。表2参考保留时间、
11、监测离子对和裂解能量化合物名称 保留时间rain 监测离子对(mz) 裂解能量ev8435017387 36螺旋霉素 4738435054009 29411】2111984 25吡利霉素 4784111z36302 146884615820a 35竹桃霉素 562688，4654430 208695717383。 41替米卡星 5838695715589 37734：81157881 33红霉素 61Z7341857613 209163617380 38泰乐菌素 6339163677218 288为定量离子对，对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。GBT 229
12、88-2008743液相色谱一串联质谱测定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与混合基质标准校准溶液中对应的保留时间偏差在4-25之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 l相对离子丰度K K50 20K50 i0K20 K10l允许最大偏差 士20 士25 土30 507432定量测定在仪器最佳工作条件下，对混合基质标准校准溶液进样，以峰面积为纵坐标，混
13、合基质校准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。上述色谱和质谱条件下，标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76回收率试验吸取适量混合标准工作溶液，用空白基质溶液稀释成所需浓度的标准校准溶液。阴性样品中添加标准溶液，按71和72操作，测定后计算样品添加的回收率，回收率范围参见附录B中的表B1。7，7空白试验除不称取样品外，均按上述步骤进行。8结果计算试样中分析物的残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：x：兰獬 式中：x，试样中被测组分残留量，
14、单位为微克每千克(pgkg)；c。从标准工作曲线得到的被涮组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)v。样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m。样品溶液所代表最终试样的量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表4和表5。4GBT 22988-2008表4牛奶中四种分析物的添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范
15、围 重复性限r 再现性限R螺旋霉素 110 lg r一1134 4k卅一0876 5 tgR=0822 1 lg0 499 5吡利霉素 110 同0 176 2m 0035 6 R一0210 4 m+017l 2竹桃霉素 110 tg r一0990 9 Igm一0 812 1 lgRii01 0 lgm 0551 9替米卡星 110 r一0 135 m+0000 2 R一0406 1m 0311 8红霉素 110 lg T-0829 4lgm一0 914 4 IgR=0844 2 Igm一0630 6泰乐菌素 110 lg r一1175 5 tgm一0888 3 19R一0954 4lgm一0
16、561 3注：m为两次测定值的算术平均值。表5奶粉中四种分析物的添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R螺旋霉素 880 lg T-0974 019m一0697 3 lgR=0856 5 tg m一0409 2吡利霉素 880 剐0 18110 067 5 R一0205 5优+1186 6竹桃霉素 880 同0 138 7优+0292 4 R一03701m 1413 4替米卡星 880 T-0，137 4 m+0236 4 R：0 372 7m一2124 9红霉索 880 Ig r=0 840 4lgm一0659 4 19 R=0844
17、8 lgm 0502 6泰乐菌素 880 Ig r1 069 9Igm一08131 IgR一0958 5 lgm一0534 8注：m为两次测定值的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(尺)，被测物的添加浓度范围及再现性方程见表4和表5。GBT 22988-2008附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素标准物质多反应监测(MRM)色谱图见图A1。688竹4桃6霉54素43。 lltminRT：0 0010 50R
18、T：58381；50010050图A1 标准物质多反应监测(MRM)色谱图rain附录B(资料性附录)回收率六种化合物的添加浓度及其平均回收率范围数据，见表B1。表B1 六种化合物的添加浓度及其平均回收率范围数据GBT 22988-2008牛奶 奶粉化合物名称掭加浓度(pgkg) 平均回收率范围 添加浓度(”gkg) 平均回收率范围1 78087o 8 79198o2 78o95o 16 794981螺旋霉素5 8Z2972 40 79810510 78o964 80 7961051 77o97o 8 77 89662 73 0945 1 6 70o944吡利霉素5 812100 40 683
19、92 010 78392o 80 78 49451 780105 8 74898 12 75O935 16 856105竹桃霉素5 82298o 40 80399810 74596o 80 793105l 85o108 8 7691092 725945 16 81398 1替米卡星5 776966 40 838III10 72493 6 80 81110ll 740950 8 7348942 815965 16 850944红霉素5 770936 40 76010110 79491I 80 7709461 770880 8 8I01052 76O89O 16 78196 9泰乐菌素5 792950 40 838107i0 740926 80 78 6985
