1、ICS 67050X 04 a酋中华人民共和国国家标准GBT 23788m2009保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效液相色谱法Determination of soybean isoflavone in healthcare fOOdHighperformance liquid chromatography200905-18发布 2009-12-01实施宰瞀髅紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会促19刖 昌GBT 23788-2009本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国特殊膳食标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：北京市朝阳区产品质量监督检验所、红牛维他命饮料有限公司、中国食品发
2、酵工业研究院。本标准主要起草人：崔岩、邢晓慧、张立刚、钟其顶、张淑玲、郎涛、苏文英、吴镇君、仇凯。1范围保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效液相色谱法GBT 23788-2009本标准规定了保健食品中大豆异黄酮的测定方法。本标准适用于以大豆异黄酮为主要功能性成分的保健食品(片剂，胶囊、1：1服液、饮料)，也可用于保健食品原料中大豆异黄酮含量的测定。本标准的检出限：固体、半固体样品大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素组分的检出限均为5 mgkg；液体样品的大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素组分的检出限均为02 mgL。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准
3、的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31大豆异黄酮soybean isoflavone大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的总称，黄酮类物质。分子式如下：大豆苷；Cz，H。O。，大豆黄苷：C22H：20。，染料木苷：c2。H：。O。大豆素：
4、C。H。oOt，大豆黄素：c-eH，zOs，染料木素：c15H1005。4方法提要样品制备、提取、过滤后，经高效液相色谱仪分析(c，。柱分离)，依据保留时间定性，用外标法定量。5试剂和材料本标准使用符合GBT 6682规定的一级水。除另有规定仅使用分析纯试剂。51乙腈：色谱纯。52甲醇：优级纯。53 80甲醇：用甲醇80 mL，加水20 mL，混匀。54磷酸。55磷酸水溶液：用磷酸调节pH至30，经045 pm滤膜过滤。56二甲基亚砜：色谱纯。57 50二甲基亚砜溶液：取二甲基亚砜50 mL，加水50 mL，混匀。58大豆异黄酮标准贮备溶液：称取大豆苷(daidzin)、大豆黄苷(glycit
5、in)和染料木苷(genistin)、大豆】GBT 23788-2009素(daidzein)、大豆黄素(glycitein)和染料木素(genistein)(纯度均为980以上)各4 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加入二甲基亚砜(56)至接近刻度，超声处理30 rain，再用二甲基亚砜(56)定容。各标准贮备溶液浓度均为400 ragL(大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素)。59大豆异黄酮混合标准使用溶液：80 mgL混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液(58)各02 mL于10 n1L容量瓶中，加入等体积水，用
6、50二甲基亚砜溶液(57)定容。160 mgL混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液(58)各04 mL于10 mL容量瓶中，加入等体积水，用50二甲基亚砜溶液(57)定容。240 mgL混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液(58)各06 mL于10 mL容量瓶中，加入等体积水，用50二甲基亚砜溶液(57)定容。320 mgL混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄昔、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液(58)各08mL于10mL容量瓶中，加入等体积水，用50二甲基亚砜溶
7、液(57)定容。400 mgL混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液(58)各10mL于10mL容量瓶中，加入等体积水，用50二甲基亚砜溶液(57)定容。6仪器和设备61高效液相色谱仪：带紫外检测器(或二极管阵列检测器)。62超声波振荡器。63分析天平：感量001 mg。64酸度计：精度002 pH。65离心机：转速不低于8 000 rmin。66滤膜：孔径为045 btm。67容量瓶：10 mL。7分析步骤71样品处理711 固体样品、半固体样品：固体样品粉碎、磨细(过80目筛)、混匀，半固体样品混匀，称取样品005 go5 g(精确至0
8、1 mg)，用80甲醇溶液(53)溶解并转移至50 mL容量瓶中，加入80甲醇溶液至接近刻度。712液体样品：吸取混匀的液体样品05mL50mL于50mL容量瓶中。加入80甲醇溶液至接近刻度。713将上述样品溶液(711或712)用超声波振荡器振荡20rain，用80甲醇定容，摇匀。取样品溶液置于离心管中，离心机离心15 min(转速大于8 000 rmin)。取上清液用滤膜(66)过滤，收集滤液备用。72色谱条件721色谱柱c，。，46 ram250 mFIl，粒度5 pm不锈钢色谱柱；也可使用分离效果相当的其他不锈钢柱。722流动相流动相A：乙腈(5I)。流动相B：磷酸水溶液(pH=3O)
9、(55)。723梯度洗脱条件见表1。表1GBT 23788-2009时间min 0 10 23 30 50 55 56 60流动相A 12 18 24 30 30 80 12 12流动相B 88 82 76 70 70 20 88 88724流速；10 mLmin。725波长：260 11111。726进样量：10 pL。727柱温：30。73测定731定性分别将大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素的标准贮备溶液(58)稀释10倍后，按色谱条件(72)进行测定，依据单一标准样品的保留时间，对样品溶液中的组分进行定性，定性色谱图参见附录A。732定量将大豆异黄酮混合标准使用溶液
10、(59)在色谱条件(72)下进行测定，绘制以峰面积为纵坐标、混合标准使用溶液浓度为横坐标的标准曲线。将713制备的样品溶液注入高效液相色谱仪中，保证样品溶液中大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的响应值均在工作曲线的线性范围内，由标准曲线查得样品溶液中大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的浓度。8结果计算81 样品中大豆异黄酮各组分大豆苷(x，)、大豆黄昔()、染料木苷(xa)、大豆素(xt)、大豆黄素(x；)和染料木素(x。)的含量分别按式(1)计算：墨一羔揣 (1)式中：x。样品中大豆异黄酮单一组分的含量，单位为毫克每千克(mgkg)或毫克每升(ragL
11、)；c根据标准曲线得出的大豆苷(或大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素)的浓度，单位为毫克每升(mgL)；y样品稀释液总体积的数值，单位为毫升(mL)；m固体、半固体样品质量的数值，单位为克(g)；液体样品体积的数值，单位为毫升(mL)。82样品中大豆异黄酮总含量，按式(2)计算：X=X。+X：+X。+X。+墨+Xs式中：x样品中大豆异黄酮总含量，单位为毫克每千克(mgkg)或毫克每升(mgL)；x，样品中大豆苷的含量，单位为毫克每千克(mgkg)或毫克每升(ragL)；x。样品中大豆黄苷的含量，单位为毫克每千克(mgkg)或毫克每升(mgL)墨样品中染料木苷的含量，单位为毫克每千克
12、(mgkg)或毫克每升(mgL)；x。样品中大豆素的含量，单位为毫克每千克(mgkg)或毫克每升(mgL)；x；样品中大豆黄素的含量，单位为毫克每千克(mgkg)或毫克每升(ragL)；x。样品中染料木素的含量，单位为毫克每千克(mgkg)或毫克每升(mgL)。计算结果应表示到小数点后一位。9精密度在重复性条件下，两次独立测定结果之差不得超过算术平均值的lOW。GBT 23788-2009毫吸光单位350250200150-50附录A(资料性附录)标准样品色谱图1 2 3 4 5； ； ；嚣 e i i 贡1大豆昔(daidzin)；2大豆黄苷(glycitin)；3染料木苷(genistin)；4大豆素(daidzein)；5大豆黄素(glycitein)；6染料木紊(genistein)。图A1大豆异黄酮标准品的HPLC色谱图保留时问rain
