1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1699.3-2006 猪流行性腹泻间接斑点酶联免疫服附试验操作规程Protocol of indirect dot enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of porcine epidemic diarrhea 2006心1-26发布060712000108 2006-08-16实施中华人民共和国发布图家质量监督检验检茂总局目。吕SN/T 1699分为二三部分:一一猪流行性腹泻微最血清中和试验操作规程;一一猪流行性腥泻病毒直接免疫荧光试验操作规程;一猪流行性腹泻间接斑点酶联免疫吸附
2、试验操作规程。本部分为SN/T1699的第3部分。本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性蹄录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本部分主要起草人z陈茹、罗琼、林志雄、刘琳琳。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SNjT 1699.3-2006 I SN/T 1699.3-2006 51 猪流行性腥泻(porcineepidemic diarrhea , PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪蹄道传染病，临床表现与猪传染性商肠炎(TGE)十分相似。1978年，比利时首次证实该病病
3、原为冠状病毒。由于缺乏稳定的疫苗生产，该病已成为欧、亚洲养猪业发达的国家和地区猪病前治的重点研究对象，并被列入我国进境动物工类传染病名录。PED在流行病学、11伍床表现和病毒形态等方面与TGE无显著区别，确诊主要借助特异性血清学和分子生物学方法。运用间接法斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)能快速拉测到感染动物血清中存在的PEDV抗体，尤其适用于大批量样品的初筛检测。E SN/T 1699. 3-2006 猪流行性腹泻间接斑点酶联免疫吸附试验操作规程1 范翻SN/T 1699的本部分适用2 规范性引用文件GB/T 6682 3 原理基本相同，不同之处在方法。、疫情监测和流行病学调查。乐部
4、分的条款。凡是注目期的引用文马用于本部分，然而，鼓勋提据本部分达成是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本酶联免疫吸附试验(ELISA)体，并选用不溶性的供氢体做为显色底物，结果以在基质膜上出现有色斑点来判定。4 缩暗语下列缩略语适用于4. 1 Dot-ELISA 4.2 HRP-SPA 辣根过氧化物5 设备和器材5. 1 摇床。5.2 恒翻培养箱。5.3 可谓单道、八道5.4 硝酸纤维素微孔滤膜(0.25.5 微量细胞培养板(96孔)。5.6 蒸汽消毒器。5. 7 手术剪、慑子、铅笔(HB)、直尺。6 试剂本部分使用的试剂除特殊规定外，均为分析纯试剂。1 SN/T 1699.3 2006 6
5、. 1 7.1 试验用蒸锚水应符合GB/T6682关于工级水的规定。6.2 溶谛O. 01 mol/L pH7. 2磷酸盐缓冲液L封闭液、洗涤液，底物液。配制方法见附录A。6.3 拉原由指定单位提供，按说明书使用;或参见附录B制备。6.4 应清6.4. 1 标准隔性血清(-20oC冻存备用)，由指定单位提供。6.4.2 标准阴性班清(-20.C冻存备用)，由指定单位提供。6.4.3 待检血清z无菌采集待检动物血液，分离血清，不加任何防腐齐。6.5 HRP-SPA 商品化生化试剂。使用前按说明稀释成工作浓度。7 操作方法7. 1 制备诊断膜用铅笔在微孔滤膜上划5mmX5 mm方格，蒸锚水漂洗一次
6、，室温(l8.C25.C)晾干，每一小格点1L拉原溶被(1mg/mL)，室温自然干燥，置封闭液中，在脱色摇床上室温缓慢振荡漂洗1h，取出用蒸馆水漂洗三次，室温自然干燥后，立即使用，或用保鲜袋封好置4.C备用。7.2 间接法Dot咀LISA操作步骤7.2. 1 将待检血清、标准llE性血清和标准阴性血清用0.01mol/L pH7. 2磷酸盐缓冲液做1: 100 稀释。7.2.2 将诊断膜剪成5mmX5 mm大小的小片，按每孔一片置96孔绵跑培养板中。7.2.3 按表1加入100L/孔稀释的血清，每份血清做双孔反应，37.C恒温培养箱内反应1ho 表196孔板检测加样图1 2 3 4 5 6 7
7、 8 9 10 -11 A 标准阳性血清样品7样品15样品23样品31样品39B 标准阴性血清样品8样品16样品24样品32样品40C 样品1中学品9样品17样品25样品33样品41D 祥品2样品10样品18样品26样品34样品42E 祥品3样品11样品19样品27样品35样品43F 样品4样品12样品20样品28样品36样品44G 样品5样品13样品21样品29祥品37样品45日样品6样品14祥品22样品30祥品38样品4612 7.2.4 洗涤:用移被器吸出各孔内血清，每孔加入250L洗涤液，室温在摇床上振荡漂洗1min，用移.液器吸干液体，重复洗涤三次，最后吸干液体。7.2.5 每孔加H
8、RP-SPA工作液100L，37.C恒温培养箱内反应1ho 7.2.6 重复7.2.4.7.2.7 每孔加底物液100L，室温避光显色5min，水洗终止反应。7.3 补充说明本部分提供96孔板的操作方法。本部分所建立的方法亦适用于平血、24孔板或48孔板等器材，但所加入的样品液体积和各步骤的溶液体积应作相应调整，要求能浸没诊新膜。SNjT 1699.3一20068 结果判定肉眼观察，限性对照膜应出现棕红色或深褐色圆形斑点，阴性对照膜应无显色斑点。对照成立的情况下，肉眼观察各个被检样品膜，凡出现棕红色或深褐色圆形斑点者判为阳性(十), 与阴性对照相同不呈现可见斑点者判为阴性(一)，介于两者之间判
9、为可疑(土)。对可疑血清样晶莹试一次，第工次检测呈现阳性或可疑反应则判为陆性，否则判为阴性。3 J SN/T 1699.3-2006 称取71.63 g A.2 0.2 mol/L 0.2 mol/L磷酸二氢锵蒸恼水0.1 mol/L pH7. 2 氧化铀(NaCD蒸锚水A.5 封闭溜0.01 mol/L pH7. 2磷酸盐F称取5g脱脂奶粉，加A.6 洗涤液0.01 mol/L pH7. 量取1000mL O. A.8 底物遗甜呆A(规范性附录试剂的配制30%双氧水(H202)0.15 mL 临用前新鲜配制，配后立即使用。4 1 000 mLo . 1 000 mLo ，充分溶解，贮40C，
10、当天使用。mLo B. 1 仪器设备B. 1. 1 细胞培养用品和设备B. 1.2 高速冷冻离JL机。B. 1.3 台式高速离心机。B. 1.4 磁力揽拌器。B. 1.5 分光光度计。B. 2 材料SN/T 1699.3-2006 附录B(资料性附录)猪流行性腹泻病毒抗原的制备方法清的199培养液，均用微孔滤膜年过掠除菌二分装后置备野抹在割不超过60d。使用时加抗生素储存液(终浓度为每毫升培养液或维持被含青霉素100IU和链霉素100g)，并用7，5%碳酸氢铀榕液谓pH值至7.07. 50 B.2.4 试剂聚乙二黯6000CPEG6 000) , B. 3 PEDV就原制备步黯B. 3. 1
11、病毒增殖取1mL PEDV病毒被细胞培养瓶)，吸附1ho弃72 h96 h，当75%95B. 3. 2 抗原制备用9000Xg，40C离心30min, j中液洛解，景是40C过夜;用台单层的缩跑用10mL 370C恒温箱中培养上清，在缓慢揽拌的情.5 mol/L，置40C过夜;Jol/L, pH7. 2的磷酸盐缓5分光光度计检测蛋白质放1 mg/mL的工作浓度。5 CON-的.户阔气军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准猪流行性膜泻间接斑点酶联免瘟眼附试验操作规程SN/丁1699.3-2006喜坠中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷* 开本880X1230 1/16 印张O.75 字数11千字2006年4月第一版2006年4月第一次印刷印数1-20009奄书号:155066 .会16755定价8.00元SN/T 1699.3 2006
