1、ICS 67040X 00中华人民 共禾口 国国家标准农业部1025号公告一192008动物源性食品中玉米赤霉醇类药物残留检测液相色谱一串联质谱法Determination of zeranols residues in animal derived foodHPLCMS，MS Method20080429发布 2008-0429实施中华人民共和国农业部发布咖。刖 舌农业部1 025号公告一1 92008本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归13。本标准起草单位：中国农业大学国家兽药残留基准实验室。本标准主要起草人：沈建忠、丁双阳、肖希龙、张素霞、李晓薇、夏曦、江海洋、
2、李建成、史为民、程林1范围农业部1025号公告一192008动物源性食品中玉米赤霉醇类药物残留检测液相色谱一串联质谱法本标准规定了动物源性食品中玉米赤霉醇类药物残留检测的制样和液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于猪、牛、鸡的肌肉、肝脏，牛奶和鸡蛋中n一玉米赤霉醇、口玉米赤霉醇、a一玉米赤霉烯醇、口一玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮单个或多个混合物残留量的液相色谱一串联质谱检测和确证。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这
3、些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和试验方法农牧发EZ0033号兽药残留试验技术规范(试行)3制样3 1样品的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试动物组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。取适量新鲜或解冻的牛奶，混合均匀，6 000 rmin离心5 min，取下层。取适量新鲜的鸡蛋样品，去壳后混合均匀。3 2样品的保存-20以下贮存备用。4测定方法4 1方法原理或提要试料中的玉米赤霉醇类药物经甲醇(或乙腈)提取，正己烷脱脂及氨基固相萃取柱或MAX固相萃取柱净化后，用液相色谱串联质谱检测，色谱保留时间和质谱碎片离子共同定性，外标法定量
4、。4 2试剂和材料以下所用试剂，除特殊注明外均为分析纯试剂，水为符合GBT 6682规定的一级水。4 2 1 a玉米赤霉醇、口玉米赤霉醇、a玉米赤霉烯醇、p一玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮标准品纯度均大于97。4 2 2甲醇色谱纯。4 2 3正己烷色谱纯。4 2 4乙腈色谱纯。4 2 5乙酸色谱纯。4 2 6乙酸乙酯。4 2 7氢氧化钠。1农业部1025号公告一1920084 2 8硫酸。4 2 9无水硫酸钠。4 2 10氨水。4 2 11 正己烷一乙酸乙酯(60+40，vv) 准确量取正己烷60 mL和乙酸乙酯40 mL，混匀。4 212正己烷乙酸乙酉匕(20+80，vv)准确量取正
5、己烷20 mL和乙酸乙酯80 mL，混匀。4 213正己烷乙酸乙酯(45+55，vv)准确量取正己烷45mL和乙酸乙酯55mL，混匀。4 214正己烷乙酸乙酯(1090，vv)准确量取正己烷10 mL和乙酸乙酯90 mL，混匀。4 215硫酸溶液82mL水中加18mL浓硫酸，混匀。4 216甲醇一氨水水(5-5-90，vvv)准确量取甲醇5 mL、氨水5 mL、水90 mL，混匀。4 217 2甲醇一乙酸乙酯移取2 mL甲醇、量取98 mL乙酸乙酯，混匀。4 218 5甲醇一乙酸乙酯移取5 mI。甲醇、量取95 mL乙酸乙酯，混匀。4 219 2乙酸乙腈移取2mL乙酸、量取98mL乙酸乙酯，混
6、匀。4 220标准储备液(100“gmL)：精确称取适量的a一玉米赤霉醇、卢一玉米赤霉醇、a一玉米赤霉烯醇、口一玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮，用甲醇分别配成浓度为100 ugmL的标准储备液，-20冰箱中保存，有效期1年。4 221混合标准储备液(1gmL)：分别准确吸取10 mL的“一玉米赤霉醇、卢一玉米赤霉醇、n一玉米赤霉烯醇、口一玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮标准贮备液至100mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，-20冰箱中保存，有效期6个月。4 3仪器和设备4 3 1 液相色谱一串联质谱联用仪(配电喷雾离子源)。4 32涡动仪。4 3 3离心机。4 3 4天平：感量为001
7、 g。43 5分析天平：感量为0000 01 g。4 3 6组织匀浆机。4 3 7旋转蒸发仪。438氮吹仪。439固相萃取装置。4 3 10 SepPak氨基固相萃取柱或相当者，规格为500 mg，3 mL。4 3 11 Oasis MAx固相萃取柱或相当者，规格为60 mg，3 mL。4 4测定步骤4 4 1试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料。取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 4 2提取与净化4 4 21肌肉组织样品称取5 g+O02 g试料于50mL离心管中加甲醇15mL，涡动1min，4 000 rm
8、in离心10min，取上清液于另一离心管中。重复提取一次，合并两次提取液。加正己烷20mL，手摇20次，3 000 rmin离心2农业部1025号公告一1920085min，弃上层正己烷。再加正己烷20mL重复脱脂一次。下层转至100mL鸡心瓶中，50旋蒸至近干，加乙酸乙酯5mI。，涡动1rain，静置10 S，上清液转移至50mL离心管。鸡心瓶中加正己烷10mL，涡动30 S，静置10 S，上清液转移至同一个离心管。再用正己烷10 mL洗涤鸡心瓶一次，合并3次残余物溶解液，备用。氨基固相萃取柱上加无水硫酸钠2 g，用玻璃棒敲匀。依次用乙酸乙酯和正己烷各5 mL活化，取备用液全部过柱，再依次用
9、正己烷、正己烷一乙酸乙酯(6040，vv)各5 mL淋洗。依次用正己烷乙酸乙酯(2080，vv)和乙酸乙酯各4 mL洗脱，合并两次洗脱液，50氮气吹干。残余物中加乙腈05 mL，涡动1 min，加水05 mL，混匀，过02“m有机滤膜，供液相色谱一串联质谱仪测定。注：周相萃取上样液流速不超过1 mLmin。4 4 2 2肝脏组织样品称取5 g-002 g试料于50mL离心管中，加甲醇10mL，涡动1min，4 000 rrain离心5min，取上清液于另一离心管中。重复提取一次，合并两次提取液。加正己烷10 mL，手摇20次，4 000 rrain离心5 min，弃上层正己烷。下层于50氮气下
10、吹干，加乙酸乙酯5 mL，涡动1 min，再加正己烷20 mL，涡动30 S，4 000 rmin离心5 min，取上清液备用。氨基固相萃取柱上加无水硫酸钠2 g，用玻璃棒敲匀。依次用乙酸乙酯和正己烷各5 mL活化，取备用液全部过柱，再依次用正己烷、正己烷乙酸乙酯(45+55，vv)各5 mL淋洗。依次用正己烷一乙酸乙酯(20+80，vv)和2甲醇乙酸乙酯各5 mL洗脱，合并两次洗脱液，50氮气吹干。残余物中加乙腈05mL，涡动1min，加水05mL，混匀，加正己烷2mL，涡动30 S，9 000 rmin离心5 min，取下层清液，过02“in有机滤膜，供液相色谱一串联质谱仪测定。注：固相萃
11、取上样液流速不超过1 ml。rain。4 4 2 3牛奶样品量取5omL试料于50 mL离心管中，加18的硫酸溶液o1 mL，涡匀，静置10 rain，加正己烷10 mL和乙腈20 mL，3 000 rmin振荡10 min，4 000 rmin离心10 min，弃正己烷层。取提取液125mL于离心管中，50下氮吹至小于01 mL。加水10 mL，用5 tooLL Na0H调节pH至110，9 000 rmin离心5 min，备用。MAx固相萃取柱依次用甲醇、水各2 mL活化和平衡，将备用液过柱，依次用甲醇氨水水(5+5+90，vvv)1mL和甲醇05mL洗涤，用2乙酸乙腈4mL洗脱，收集洗脱
12、液，50下氮气吹干。残余物中加乙腈05 mL，涡动1 min，加水05 mL，混匀，过02 MITs有机滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。4 4 2 4鸡蛋样品称取5 g-o02 g试料于50mL离心管中，加乙腈10mL，涡动1min，9 000 rmin离心5min，取上清液于另一离心管中。重复提取一次，合并两次提取液。取125 mL于离心管中，50下氮吹至小于01mL。加水10mL，用5moLLNaOH调节pH至110，9 000 rmin离心5min，备用。MAX固相萃取柱依次用甲醇、水各2 mL活化和平衡，将备用液过柱，依次用甲醇氨水一水(5+5+90，vvv)1 mL和甲醇05 mL洗
13、涤，用2乙酸乙腈4 mL洗脱，收集洗脱液，50下氮气吹干。残余物中加乙腈05 mL，涡动lmin，加水05 mL，混匀，过02“ITI有机滤膜，供液相色谱一串联质谱仪测定。4 4 3空白添加标准曲线的制备分别精密量取6种玉米赤霉醇类药物混合标准贮备液适量，添加到5 g(mL)空白试料中，制得浓度在0”gkg(L)100 pgkg(L)范围内的57个不同添加浓度的试料，按442步骤操作，供液相色谱串联质谱仪测定。4 4 4测定农业部1025号公告一1920084 441液相色谱参考条件色谱柱：XBridge C8(21150mm，粒径5zm)，或相当者；流动相：A相：002乙酸乙腈溶液；B相：0
14、02乙酸水溶液流速：02 mlmln；柱温：室温；进样体积：20“L；梯度洗脱条件见表1。表1梯度洗脱条件时间(mln) A相() B相()O 15 858 90 1013 90 1014 15 8520 15 854 442质谱参考条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；电离电压：30 kV；离子源温度：80；雾化温度：300；雾化气流速：450 Lh；反吹气流速：25 Lh；Q1，Q3均为单位分辨率；药物保留时间、定性定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2。表2玉米赤霉醇类药物的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量保留时间 定性离子对 定量离子对 锥孔电压
15、 碰撞能量药物名称(min) (mz) (mz) (V) (eV)a一玉米赤霉醇 11 18 321277 321二277 40 20321303 40 23口玉米赤霉醇 1065 321277 321277 40 20321二303 40 23a一玉米赤霉烯醇 1130 319275 3192275 40 20319301 40 22口玉米赤霉烯醇 1076 319275 319275 40 20319301 40 22玉米赤霉酮 1227 319275 319275 40 20319205 40 20玉米赤霉烯酮 12 36 317273 317273 40 18317175 40 184
16、4 4 3测定法取试料溶液和空白添加标准溶液，作单点或多点校准，外标法计算试料中药物的残留量。试料溶液4农业部1025号公告一192008及空白添加标准溶液中a一玉米赤霉醇、口一玉米赤霉醇、a玉米赤霉烯醇、卢一玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。试料溶液中的离子相对丰度与空白加标准溶液中的离子相对丰度比符合表3的要求。空白添加标准溶液的质量色谱图和玉米赤霉醇类药物子离子的质谱图见附录A中的图A，l图A5。表3试料溶液中离子相对丰度的允许偏差范围445空白试验取空白试料，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。4 5结果计算和表述试样中玉米赤霉醇类药物的残留量
17、按式(1)或式(2)计算：单点校准：。XAm，“百“或空白添加标准曲线校准：由A，一aX：+6，求得“和b，则 X一迦A，m式中：x供试试料中玉米赤霉醇类药物残留量，“gkg(L)；x，空白添加试料中相应玉米赤霉醇类药物的浓度，,gkg(L)A供试试料溶液中相应玉米赤霉醇类药物的峰而积；A空白添加试料溶液中相应的玉米赤霉醇类药物的峰面积；in，空白添加试料质量或体积，g(mL)；m供试试料质量或体积，g(mL)。5检测方法灵敏度、准确度和精密度(2)5 1灵敏度猪、牛、鸡的肌肉、牛奶、鸡蛋中a一玉米赤霉醇、口玉米赤霉醇、a一玉米赤霉烯醇、p玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮的检测限为05
18、ugkg(L)，定量限为10 pgkg(L)。猪、牛、鸡的肝脏中a玉米赤霉醇、口玉米赤霉醇、a玉米赤霉烯醇、卢一玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮的检测限为10“gkg，定量限为20 p-gkg。5 2准确度本方法在猪、牛、鸡的肌肉、牛奶、鸡蛋中，在10,gkg(L)50gkg(L)添加浓度范围内回收率水平为60120。本方法在猪、牛、鸡的肝脏中，在20tgkg100tgkg添加浓度范围内回收率水平为60120。5 3精密度本方法的批内相对标准偏差20，批间相对标准偏差20。农业部1025号公告一192008附录A(资料性附录)玉米赤霉醇类药物特征离子质量色谱图和质谱图100j 1弹5 3
19、17273诅一 一 一一一一一厶一一一769100 1弹5 3171744姐一一一一一一一一警型斗磐錾霉809ZER R2008040809 姐一一 一一一 么一一一1。36。1罨戳一2芝坠一一一：，301。1001 10 76 1坤o 319275姐一一一么斗一一一一一一861100| 1必8 1必9 321303诅錾一277_ 133e3o。面矿zt惫弄丽洒r一”me图A 1 牛肌肉中玉米赤霉醇类药物的基质添加标准溶液特征离子质量色谱图D图A 2一。玉米赤霉醇与口玉米赤霉醇子离子质谱图农业部1025号公告一19200827 59158 88 173 58 300 80I，187 71 25666I i 11 l_c400图A 3卢一玉米赤霉烯醇与口一玉米赤霉烯醇子离子扫描质谱图图A4玉米赤霉酮子离子扫描质谱图农业部1025号公告一192008嚣；： 炒4272 551_ 1了lOO 150 200 250 300 350 400图A 5玉米赤霉烯酮子离子扫描质谱图
