1、中华人院共和国盟家标准工业锤环冷却水中站混真蕾的黯定平皿计数法Indusl:rial circulating cooling water一Examinatonof slime formed fungi-Standard of plate count 1 主题内容与运用范围本标准规定了滋环冷却水中粘泥真蕾部测定方法。GB/T 14643.3-93 本标准适用于工业循环冷却水中粘泥真菌的测定，也适用于原水、生活用水及其他水中粘泥真菌的测定。2 引用标准GB 603 化学试剂试验方法中所周制知j及制品的制备GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 方法提要本法采用25号浮游生物网收集结环冷却水
2、中的事古董呈，所得的粘泥用石英砂充分研磨使级穗分散，再利用平皿i十数技术在29士rc培养72h来测定粘泥中真菌总数。4 试剂和材料本泌定方法中，I蒙特殊烧定外，应使用分析纯试剂和符合GB6岳82中三级水魏格放水。4. 1 马铃薯:市管新鲜无芽)，去皮后切成约20mmX 20mm X 20mm小块，4.2 葡萄糖(HG3-1094); 4.3琼脂z生物试剂$4.4 石英砂;Z10150阳在(70100g ), 4.5 拭化纳(GB126号h4.6 乳酸$4.7 乙醇(GB6781，75%(V/V)溶液$4.8 牛皮纸;4.9 1军F毒草草黯擒g4. 10 医用脱腾纱布。5 仪器和设备5. 1 :
3、毛离箱(在或超净工作会$5.2 蒸汽压力灭菌器;5. 3 I主化培养箱g因家技术监督局1993-08-06批准1994-07-01实施511 GB/T 14643.3 93 5.4 鼓风电热干燥箱=温度oJ控制在(60280)土2C.5. 5 铝锅，200mm;5.6 25号浮游生物网p5. 7 转子流量意t(O2四!h);5.8 瓷研钵$5.9 搪瓷量杯;lOOOmL; 5.10 磨口三角瓶:1OOOmL. 5.11 培养llll,90mm , 5今12容量瓶，1000回L;5.13 刻度吸管，!mL，5. 14 刻度吸管;5mL;5. 15 三角瓶，500mL;5. 16 锺筒，500mL
4、，5.17 量满.25mL。6 试验前的准备6.1 培养葵必普普备称取约200革的马铃薯子铝锅中，加水约lOOOmL子也炉上加热，煮沸10mn并不断搅拌，趁热用四层医用脱舱钞布过滤于搪3撞撞杯中，收集资j约900mL滤液，滤液搅匀待用于t述挂靠液中加入20.0日琼脂和20.0日葡萄糖，并放在电炉上加热，不断地搅拌，待琼脂完全溶化后，趁热用四庭医用脱nl纱布过滤，待滤液不再满出时，用水补充至1000mL.并用乳酸调节pH至4.0士0.1.并分装在500mL三角瓶中，每巍分辈辈爱不起过其总戴灼三分之二，塞上橡塞再用牛皮纸纪瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器于121士1C灭茵lSmin.6.2 无菌稀释水的
5、制备6.2.1 生理裁水的配司jIf，称取8.5g氯化锁，溶解在1000mL水中，混匀。6.2.2 将生穰盐水付.2.1)分毒是在1OOOmL 屠口三角瓶中，每辈革45mL，每个三角瓶塞子牵挂瓶口问插入一小纸片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭茜器于121士1C灭茵15mn。6.3 刻度吸管的灭茵6.3丁将洗净并烘干后8号吸管程端塞上医照E量监穗，梅花索要适宜，长E重大约1015mm.棉花量不宣露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉e6.3.2 每交刻度吸管用一条约40-S0mm宽的牛皮纸条，以45左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端将多余的纸条折叠打结，不使散
6、开，标上量度，翁干支捆成一来，置电热干燥箱中于160土2C灭茵拙。6.4 培养E茸的灭蜜将洗净并烘干后的培养lllllO个左右叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，章里也热干燥箱中于160士2C灭菌2h.6.5 1英砂的灭菌将洗净并烘干后的石英砂装入磨口三角瓶中，按(6.2.2)包扎，灭菌。1 测定步骤7.1 样品的采集7. 1. 1 采集粘泥的装宣见下m.512 GB/T 14643.3-93 , 4 l 转子流量计，2浮游生物网，3-JjlX-l0截止阀，4-X43W-l0旋塞阀，5一量筒7. 1. 2 调节采样装置中的阅门，使冷却水的流速控制在0.8m/s左右，水流量在1m/h左右，然后关上浮游生
7、物网的旋塞阀，过滤1m水。7. 1. 3 关闭水阀，取下浮游生物网，打开旋塞阀，将粘泥收集在一个500mL量筒内，沉淀30min后倾出上层清液。将剩余浊液转至25mL量筒内，静置30min，记录沉淀出的粘泥体积。以mL/m表示循环冷却水中的粘泥量，粘泥量(V)按式。计算s几一叭一一V . . ( 1 ) 式中;.V2 量筒中粘泥体积，mL;F，一一通过浮游生物网过滤的循环水量，m。7. 1.4 用无菌吸管移取25mL量筒内的上清液，将量筒内的粘泥或部分粘泥(7.1.3)转移至洗净并烘干后的资研钵中，加入约2g灭过菌的石英砂(6.5) ，充分研磨后转移至1000mL洗净并烘干后的容量瓶中，月1无
8、菌稀释水稀释至刻度，充分混匀，并立即进行测定。7.2 元菌箱(室)灭菌把试验所用的无菌稀释水、无菌培养皿、无菌吸管等用品放入元菌箱(室内，打开紫外线灯灭菌30min。7.3 1且样的稀释和接种7. 3. 1 关掉紫外线灯，打开荧光灯，将粘泥水样(7.1.4)放入无菌箱中，立即用75%(V /V)的乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手，点燃无菌箱室内的酒精灯。7.3.27.3.7条的操作应在无菌箱(室内的火焰区进行。7.3.2 选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种后，培养皿中生长的菌落数小于300个，在空白稀释水样瓶(6.2)上标上稀释度数。7. 3. 3 用10倍稀释法稀释水样，即用5mL无菌吸
9、管(6.3)吸取5mL水样注入到45mL空白稀释水中充分摇匀.此时稀释度为10513 GB/T 14643.3-93 7.3.4 另取一支5mL无菌极管吸取5mL10-1水祥移入到j第二个稀释水中，充分摇匀，J1ta才稀释度为lo2，依次类推，直至需要的稀释度为止。7. 3. 5 将不问稀释度的水样分别接种到无商培养皿(6.4)巾，每个稀释度重建复接种35个阻，每皿接种lmL，接手中括:左手掌托住土营养肢，大拇指积食指轻轻将培养践提起，吸管与培养血底成45。角相接e移开吸管得吸管;在室主再磁罢j培养E草，接种时间不交超过岳。每接种一个稀释度交换一支无离破管。7. 3. 6 另取组培养皿不接水样
10、，作为空白。同时操作。7.3.7 将灭士生菌的培养基(6.1)冷却至45:t1C，按(7.3.5)掀开培养皿盏，将培养基灌入培养皿内，每股应灌1!i20mL。灌皿时不婆使培养基直接滋在水样上，灌肌后要将融化的培养基和皿中水样彻底混合，!J、心匆使混合液草草药培养豆豆约边缘。演;王在一个水样从主要种到灌E盖不得越过2min。7.4 培养待培养皿中培养基(7.3.7)固化后，倒置平皿，在生化培养箱中于29士1(;培养72h。8 计数与报告8. 1 培养之后，取出培养施，辛苦空白培养盟内出现茵落，表确测定过程中有污染，本次测定无效。8. 2 选择平均商藩数在30-300之间的稀释度，立即进行计数，求
11、得平均盲目落数，并修约成二位有效数字(见表例1)。8.3 若有两个稀释度，其生长菌落数均在30-300之间，则被二者之比值来决定，若其比偿小于2，应报告其平均数，表大于zm报告其中较小的数字觅表领12及伊j衍。自.4 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则选择稀释度最高的培养llIl.计数见表例心。8. 5 若所有稀释度的平均商落数均小于30.则应选择稀释度最低的培养皿计数(见表例5)，8. 6 若所有稀释度均无茵落生长，贝tl以小于1乘以最低稀稼倍数报告之(见表例6)。8.7 若所有草草草季度的平均穰落数均不在3号3号G之泻，其中一部分大于300商另一部分小子30时，则选择最接近30或30
12、日的培养现计数见表侧门。8.8 以个/mL表示循环冷却水中粘泥真菌的数量(X)按式(2)计算gX XI X103 白二F, .V,X10 K. X, V F. V3XI03 式P:X , 按(8.2)方法计数得出的培养皿上生长的平均商落数，个;L一按(7.1.3)记录的粘泥量，mL/m，V，一一按(7.1.4)费远定时所取的粘草草体积(V，=K.V，mL3 F一一it数组钓祥占主稀释度数。例表稀释度及商辖数两稀释度茵粘泥真菌总数例次10-1 10-2 10-3 落数之比个/四L164 20 16400 2 295 46 1. 6 37750 3 271 50 2.2 27 100 4 6500
13、 3475 313 31300 5 27 II 5 270 514 ( 2 ) 报告方式个ImL1. 6X10 3.6X10 2.7Xlo4 3.1Xl 2.7XI0 GB(T 14643.3-93 续例表稀释度及菌落数两稀释度菌粘泥真菌总数报告方式例次落数之比个/mL个/mL10- 1 10-2 10-3 6 。IXI0 10 7 12 30600 3.1X 104 9 精警度9. 1 由于微生物能以单独个体、双双成对、链状、成簇或一团团等形式存在，而且没有单独一种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落数可能要低于其正常存在的活细胞的数目。9. 2 标准平皿计数的正确度随着平行样皿的增加而增加，当使用5个平行皿，平皿加lmL样品时测定结果的置信度为95%。附加说明:本标准由中华人民共和国化学工业部提出。本标准由化学工业部天津化工研究院归口。本标准由南京大学和南京市化学工业研究设计院负责起草。本标准主要起草人曾昭琪、解正宽、王勇、张林群。5l1
