1、出国墙3金传单U毡i SN/3767.24-2014 晶中转等温扩增(第24部分:71福A哈A可ag6 飞Loop-mediaed isoher睡alamplification deecion mehod for ge到eticallymodified components in food for expor-Part 24: Rice LLRICE62 2014-01-13发布2014斗争01实施也乏与，Y飞af噩2飞网络w、飞IWcn刘fw315cm电运4y辛呛2315飞去11乃至中华人民共和且由发布国家庭贡量监督检拴捡痊总局SN/3767.24-2014 目。吕时刑人司华公津任中限刘阶责
2、、有:部拍院宣勇切仙究比志在俨哪蜘李这和澳家叫些Z旦别疫迪UM法只险M川江防如验叫颖品队Abx、龙hu检和配局Jgh疫君pi M川仁、检裕AH川局验张止，有疫检iu发。:主才川增的口地叫文扩丰15人wp因阻。千H金山山英啕辟材叮叮山拙和就晴是入广黄介即札刽础幅古小环.，.，。的专员如影卫晰暗暗L品采脱脱品时灿圳股阳周基，1协协MM肌阳1，毛品叫咱力肌毛?万加-M品ML本Mm时A共华圳吨以mMML4四日邸rM品山川削Mm口阳MM口阳四日四川4品咱附容监脱出川包且巳ZU川川Mm川川川mmmmmmntumzt四川刑时叫封封封封米一豆豆豆豆豆稻稻稻稻稻稻稻稻麦菜菜TWW，的认立金草出用选米米米米米米汗
3、玉玉玉玉玉大大大大大水水水水K水水水小甜油町G件家单检起川喃地摊433344VA川LK八川弘八KLLKLULL川LLUU七七七LLK札ULLS照文国草境要川时时时时附附时时机部部部部部部叩的背部配部配部甜部甜甜甜甜部部M时都川付印叫川一性nu-OLqu4AFDnbioOQdnu-品。qUA吐Jb巧iOOQUAUVW123456789111111111122222222223部标注部部海部卧第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本珠本国磊和石SNj3767.24一-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第24部分:水稻LLRICE62品系1
4、范围SNjT 3767的本部分规定了稻谷和大米中转基因水稻LLRICE62品系特异性的环介导等温扩增(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于进出口的稻谷和本方法的定性检测低限为0.5的定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必件。凡是不注目期的引用文件，GBjT 19495.2 GBjT 19495.3 转基因产品GBjT 19495.7 转基因产品检测A哇nu 91 。乙巧inhu 巧，anUT ,/,rJ W川法方选)检测方法第2部分:筛3 防污染措施环介导等温扩增检测过程的4 抽样与制样按照GBjT19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GBjT19495.3的规定执行
5、。6 LAMP检测方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理根据转基因水稻iLLRICE 62品系外源基因和水稻边界序列设计特异性内引物、外引物和成环引物SN/T 3767.24-2014 各一对，特异性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在水稻品系LLRICE62特异目标序列启动互补链合成，在同一链t互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2结合，产生副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6. 1. 2 显色蔽显色原理在L
6、AMP反应体系中加入预先混合的钙黄绿素和锚离子，未发生反应时锯离子与钙黄绿素结合，钙黄绿素的荧光被评灭，呈现橙色。当扩增反应发生时，扩增过程中产生的焦磷酸根离子可与健离子结合，形成不可逆的沉淀物，将锚离子从钙黄绿素上释放下来，从而使钙黄绿素恢复荧光，同时-体系中的镇离子与钙黄绿素结合，进一步加强钙黄绿素的荧光，可在365口m紫外光激发下散发出约510日m的荧光，颜色也由橙色转为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0 oC士0.5oC和80.0oC士0.5oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5fJ.L10
7、L;量程10L100L;量程100fJ.Ll 000Lo 6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs i容液:每种核背酸浓度10mmol/L。6.3.3 BstDNA聚合酶:酶浓度8U/fJ.L，建议采用NEB的Bst酶，或者具有同等效力的酶。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl (pH 值为8.8)、100mmol/L硫酸债、100 mmol/L氧化饵、20mmol/L硫酸镜、1%Triton X-100。6.3.5 硫酸镇
8、榕液:50mmol/La 6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6.3.7 显色液:钙黄绿素荧光染料，0.312mol/L。6.3.8 引物:根据转基因水稻LLRICE62品系外源基因和水稻边界序列设计一套特异性引物，包括外引物l(F3)，外引物2CB3) ，内引物1(FIP)、内引物2(BIP)和环引物1(FLP)、环引物2(BLP)。外引物扩增片段长度为226bp，序列信息见附录A。内引物1(FIP，5-3):AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGAAACCAGGTGGACTAAAAGT 内引物2(BIP , 5 -3 ): GCG AAA GGGGG A TG TGCTG TG ACTG
9、GG AAAACCCTG 环引物l(FLP，5人3):CAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC 环引物2(BLP，5-3) : GCCCGCACCGATTATTTATG 外引物l(F3，5-3):TGTAACACGCACACTCAC 夕卡引物2CB3，5-3):CTGGCCGTCGTTTTACAA 6.4 实验步骤6.4 .1 阴性对黑、阳性对照和空白对照的设置6.4.1. 1 阴性对照:2 SN/T 3767.24-2014 采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4 .1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板。6.4 .1.3 设两个空白对照:提取DNA时
10、设置的提取空白对照(以水代替样品); LAMP反应的空白对照(以DNA搭解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测为降低检测成本、避免元效操作，进行LAMP检测应先进行内源基因检测，检测结果阳性表明从样品中提取出适宜进行LAMP检测的DNA，可以进行外源基因检测;否则表明未能从样品中提取适宜进行LAMP检测的DNA，应重新进行DNA提取和纯化。内游、基因的检测参照SN/T3767.2一2014的规定进行。6.4 .3 水稻LLRICE62品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1
11、L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液棍合进入反应液中。表1水稻LLRICE62品系LAMP反应体系组分工作液浓度加样量/L反应体系终浓度ThermolPol缓冲液10 2. 5 l 环引物l(FLP)10 I- mol/L 1. 0 0.4mol/L 环引物2(BLP)10mol/L 1. 0 O. 4mol/L 外引物lCF3)10mol/L O. 5 0.2 f.L mol/L 外引物2(B3)10mol/L O. 5 0.2 I-mol/L 内引物1(FIP) 40mol/L 1. 0 1.6mol/L 内引物2CBIP) 40mol/L 1. 0 1.6mol/L dNTP
12、s 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mmol/L 硫酸续150 mmol/L l 6 mmol/L BstDNA聚合酶8 U/I- L 1 0.32 U/I- L DNA模板100日g/L2 8 ng/L 水5.5 6.4 .4 LAMP反应参数63.0 oC :1: 0.5 oC恒温扩增60m巾，80.0oC土0.5oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，立即将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，在黑色背景下进行颜色观察。3 SN/3767.24-2014 6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照L
13、AMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管8 结果表述8.1 对LAMP检测结果为阴性4 结果正常，可判断该样品检测结验对照结果正常，可判断该样品证(见附录A): 7j(吕LLRICE62品系。二以认马的样品，应按照确证实验情况进行结SN/T 3767.24-2014 甜录A(资料性附录)转基因水稻LLRICE62品系基因序列A.1 转基因
14、水稻LLRICE62品系外源基因和水韬边界序列(来自Accessonno. JQ406881. 1) 1 TGT AACACGC ACACTCACCT ACTTCCAAAG A TTT AGCGA T GTCTT ACTGC 51 TAACGGGTGC ATCG 101 TAATCGGTGC 151 201 GTTGT AAAAC GA A.2 引物耐基序列及构成FIP: 5 - AGCTGGCGT AA B1c BIP ,5- GCGAAAGGGGGA FLP , 5 -CAAGGCGA TT AAG BLP:5人GCCCGCACCGATTF3:5-TGTAACA B3 : 5 -CTGGC
15、CG TCG A AAAGTATAAA AAGGGGGATG CAGTCACGAC 严d 2日|离.hh的HZ的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第24部分:水稻LLRICE62品系SN/T 3767.24-2014 头中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址.c口中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷今印张0.75字数10千字2014年12月第一次印刷开本880X12301/16 2014年12月第一版印数1-1300 定价16.00元头书号:155066 2-27478 SN/T 3767.242014
