1、ICS 67050X 04 a目中华人民共和国国家标准GBT 22980-2008牛奶和奶粉中氟胺烟酸残留量的测定液相色谱一紫外检测法Determination of flunixin residue in bovine milk and milk pOwderLCUV method20081231发布 2009050 1实施宰瞀鹊案瓣警糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会“1刖 昌GBT 22980-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标
2、准主要起草人：宋文斌、李军、李一尘、赵景红、于一茫、李百舸、于杰、李叶、庞国芳。牛奶和奶粉中氟胺烟酸残留量的测定液相色谱一紫外检测法GBT 22980-20081范围本标准规定了原料乳和纯奶粉中氟胺烟酸(flunixin)残留量的液相色谱一紫外检测方法。本标准适用于原料乳和纯奶粉中氟胺烟酸残留量的测定。本标准的方法检出限：原料乳为50 pgL，纯奶粉为40gkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日
3、期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GBT 63791-2004，ISO 5725_1：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理样品在酸性条件下酶解用乙腈提取后，经正己烷和固相萃取柱净化，通过配置紫外检测器的高效液相色谱进行分析测定，外标法定量
4、。4试剂和材料除另有说明外，所有试剂均为分析纯。水为GBT 6682规定的一级水。41 甲酸。42冰乙酸。43筘一葡萄糖苷酸酶(p-glucuronidase)15 000 UmL：争葡萄糖苷酸酶(600 000 ug)，准确称取0050 0 g口一葡萄糖苷酸酶，加2 mL的磷酸盐(PBS)缓冲溶液溶解，用045 f*m尼龙滤膜过滤。使用前现配制。44葡萄糖。45浓盐酸。46流动相A：乙酸铵005 molL，pH50(准确称取390 g乙酸铵，加水溶解并用甲酸调整至pH50，转移至1 000 mL容量瓶中，使用前过045 pm滤膜)。47流动相B：甲醇，色谱纯。48流动相C：乙腈，色谱纯。49
5、混合流动相：将40 mL流动相B，30 mL流动相c以及30 mL流动相A相混合。410磷酸盐(PBS)缓冲溶液：称取o8 g氯化钠，o02 g氯化钾，002 g磷酸二氢钾，o115 g磷酸氢二钠和o02 g葡萄糖于250mL烧杯中加约90mL的水溶解，用01 molL磷酸调整pH60，转移至i00 mL容量瓶中并稀释至刻度。1GBT 22980-2008411 85磷酸。412乙酸钾溶液：004 molL。称取195 g乙酸钾于500 mL容量瓶中，加约450 mL水溶解并稀释至刻度。413氯化钾。414磷酸二氢钾。415磷酸二氢钾缓冲溶液：025 molL，pH70。称取1 701 g磷酸
6、二氢钾溶于400 mL水中，定容到500 mL，然后用025 molL磷酸氢二钠调节pH至7o(约500 mL)，定容到l L。416氯化钠。417无水磷酸氢二钠。418磷酸氢二钠溶液：025 mollL。称取1775 g磷酸氢二钠溶于400 mL水中，定容到500 mL。419正己烷：色谱纯。420乙酸一正己烷溶液：乙酸+正己烷(1+9)。421标准物质：氟胺烟酸葡甲胺盐，纯度99。422氟胺烟酸标准储备溶液：50-gmL。称取适量的氟胺烟酸葡甲胺盐(421)，用甲醇溶解并定容。24下保存。注：称取标准物的重量是按纯度和含盐量修正过的质量。423氟胺烟酸标准工作溶液：2 pgmL。吸取适量的
7、氟胺烟酸标准储备溶液(422)，用甲醇配制成2 pgmL的标准工作溶液，24下保存。424标准基质溶液：根据氟胺烟酸的灵敏度和仪器线性范围用空白样品提取液配制成不同浓度的标准基质溶液。5仪器51 液相色谱仪：配有紫外检测器。52电子天平：感量为001 g和0000 1 g。53离心机：最大转速为10 000 rrain。5，4离心管：50 mL聚丙烯离心管。55高速涡流混合器。56振荡器。57微量移液器：10 pL100 pL和1 000 pL5 000 pL。5。8氮气浓缩仪。59酸度计：精度为士002。510样品过滤器：PTFE，045 pm。511 固相萃取柱：Bond Elut Cer
8、tify 1I，3 mL，200 mg，或相当者。512真空固相萃取真空装置。513超声波仪。6试样的制备与保存61试样的制备将原料乳和纯奶粉样品分别混合均匀。各自分出05 kg作为试样，将分出的试样密封，并作上标记。62试样保存将试样置于4条件下贮存。27分析步骤GBT 22980-200871提取711原料乳样品称取原料乳试样200 mL，精确到001 mL放人50 mL聚丙烯离心管中，加入乙酸钾溶液(412)5 mL，高速涡旋混合10 s。混合后向样品中加入30 pL乙酸(42)，调节样品pH至45，涡旋混合。再加入70止新配制的p葡萄糖苷酸酶溶液(43)混合，于振荡器37条件下低速振荡
9、16 h。分别向样品中加入5 mL乙腈，涡旋混合5 s，离心IO rain(5 000 rrain)。转移上清液至50 mL离心管中。在原液中加入5 mL乙腈和l mL乙酸钾溶液(412)涡旋混合5 S，离心lO min(5 000 rmin)，将上清液转移至50 mL离心管中，合并上清液，待净化。712纯奶粉样品称取纯奶粉025 g，精确到001 g，放人50 mL聚丙烯离心管中加入1_75 g水超声溶解得到复原乳。加入乙酸钾溶液(412)5 mL，以下步骤同原料乳样品。72净化在混合的上清液中加入5 mL正己烷和50 pL浓盐酸，涡旋混合15 s，在5 000 rmin下离心5 rain。
10、弃去正己烷层，重复上述步骤一次。55条件下氮吹使其体积小于5 mL。加人磷酸二氢钾缓冲液(41 5)7 mL，涡旋混合，超声20 S，5条件下以5 000 rmin离心15 min。采用固相萃取柱(511)，用3 mL甲醇和3 mL水活化柱，将样品过柱，弃去过柱液，然后用3 mL水和6 mL甲醇洗柱，弃去过柱液。加大真空度抽滤10 rain。用2 mL正己烷淋洗柱子两次并弃去淋洗液。用2 mL乙酸一正己烷(420)洗涤柱子两次，用15 mL离心管收集洗涤液。在55条件下将洗涤液氮吹至干。随后，在每个样品中加入混合流动相(49)1 mL，涡旋混合5 s，超声5 S。样液用045“m的滤膜过滤到进
11、样瓶中，待测。73测定条件731液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a) 色谱柱：Inertsil DS-3，5 pm，250 mm46 ram(内径)或相当者；b)流速：04 mLmin；c)检测波长：285 Ilm；d)柱温：35；e) 进样量：20 pL；f)运行时间：30 rain。732液相色谱测定用氟胺烟酸的标准基质溶液(424)分别进样，以峰面积和工作标准溶液浓度绘制标准工作曲线，样品溶液中氟胺烟酸的响应值应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，氟胺烟酸保留时间为14 min，标准物质色谱图参见附录A中的图A1。氟胺烟酸的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1
12、。74平行试验按照上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。75空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。8结果计算试样中氟胺烟酸的残留量的测定按式(1)计算：3GBIT 22980-2008xc羔揣u 优 1 UU式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(mgkg)；c从标准曲线上得到被测组分溶液的浓度，单位为微克每毫升(pgmL)y样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度9，1一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重
13、复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，原料乳和纯奶粉中氟胺烟酸添加浓度范围及重复性方程见表1。表1 原料乳和纯奶粉中氟胺烟酸的添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克样品基质 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R原料乳 5o400 lg r-1016 lgm一114 lgR-955 lgm一1065纯奶粉 4001000 lg r=O311 lgm一0005 19R一0360 lg优一0006注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，原料乳和纯奶粉中氟胺烟酸添加浓度范围及再现性方程见表1。氟胺烟酸标准物质色谱图，见图A1。附录A(资料性附录)标准物质色谱图图A1 氟胺烟酸标准物质色谱图GBT 22980-2008GBT 22980-2008附录B(资料性附录)回收率本方法中氟胺烟酸添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B1。表B1 氟胺烟酸添加浓度及其平均回收率的试验数据原料乳 纯奶粉化合物名称舔加浓度(pgkg) 平均回收率“ 添加浓度(pgkg) 平均回收率50 9099 400 9】7710o 9391 60o 92，62氟胺烟酸200 9427 80 o 9577400 9318 1000 97 326
