1、ICS 67050X 04 a雪中华人民共和国国家标准GBT 232 1 52008贝类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定液相色谱一荧光检测法Determination of paralytic shellfish poison in shellfish-HPLCfluorescence detection method20081231发布 2009050 1实施宰瞀鹊鬻瓣訾糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会“刖 茜GBT 232152008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人
2、民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：欧阳姗、谢丽琪、朱玉兰、岳振峰、沈金灿、陈沛金、宋文斌、庞国芳。贝类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定液相色谱一荧光检测法GBT 2321520081范围本标准规定了贝类中麻痹性贝类毒素的高效液相色谱测定方法。本标准适用于贝类中麻痹性贝类毒素的测定。本标准的方法检出限：GTX4为16?zgkg；GTXl为507弘gkg；dcGTX3为48tgkg；B1为319zgkg；dcGTX2为17319kg；GTX3为65 pkg；GTX2为196 ggkg；neoSTX为157,g1【g；dcSTX为125 pgkg；ST
3、X为14，5tgkg；合麻痹性贝类毒素总量(STXeq)为125tgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第l部分：总则与定义(GBT 637912004，ISO 5725-1：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基
4、本方法(GBT 637922004，IsO 57252：1 994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理试样中的麻痹性贝类毒素用01molL的盐酸提取，离心后，将上清液过c。固相萃取柱净化，再经过分子质量10 000的分子筛超滤离心管过滤，滤液用高效液相色谱进行分离，经在线柱后衍生反应后，进行荧光检测，外标法定量。4试剂和材料除特殊规定外，所用的试剂均为分析纯。41水：GBT 6682，一级。42乙腈：色谱纯。43无水乙酸。44盐酸：3638(质量分数)。45庚烷磺酸钠。46磷酸：85(质量分数)。47二水
5、合高碘酸。48磷酸氢二钾。49氢氧化钾。410氨水。41 1 100 mmolL庚烷磺酸钠溶液：称取202 g庚烷磺酸钠(45)，用水溶解定容至1 000 mL。1GBT 232152008412 500 mmolL磷酸溶液：称取490 g磷酸(46)，用水溶解定容至1 000 mL。413 250 mmolL磷酸氢二钾溶液：称取435 g磷酸氢二钾(48)，用水溶解定容至1 000 mL。414 10 molL氢氧化钾溶液：称取561 g氢氧化钾(49)，用水溶解定容至1 000 mL。415 500 mmolL高碘酸溶液：称取1140 g二水合高碘酸(47)，用水溶解定容至1 000 mL
6、。416 10 molL乙酸溶液：称取600 g无水乙酸(43)，用水溶解定容至1 000 mL。417 001 molL乙酸溶液：量取100 mL 10 molL乙酸溶液(416)，用水稀释定容至1 000 mL。418 01 molL盐酸溶液：量取90 mL盐酸(44)，用水稀释定容至1 000 mL。419标准溶液：麻痹性贝类毒素GTXl，4、GTX2，3、dcGTX2，3、B1(GTX5)、neoSTX、STX、dcSTX标准溶液，避光保存于一20以下。420标准储备液：将标准溶液用001 molL乙酸溶液(417)稀释成一定浓度的标准储备液，避光保存于一20以下。421混合标准溶液：
7、分别准确吸取适量各标准储备液，用001molL乙酸溶液(417)配成所需浓度的混合标准溶液，现配现用。422流动相A：量取150 mL 100 mmolL庚烷磺酸钠溶液(411)、85 mL 500 mmolL磷酸溶液(412)，用约450 mL水稀释，用氨水(410)调pH至72，用水定容到500 mL，过045 pm滤膜。423流动相B：量取200 mL 100 mmolL庚烷磺酸钠溶液(411)、450 mL 500 mmolL磷酸溶液(412)，用约450 mL水稀释，用氨水(410)调pH至72，用水定容到500 mL，过045 btm滤膜。424氧化液：量取100 mL 500 m
8、molL高碘酸(415)、100 mL 250 mmolL磷酸氢二钾溶液(413)，用约450 mL水溶解，用10 molL氢氧化钾溶液(414)调pH至90，用水定容到500 mL。425中和液：10molL乙酸溶液(416)。426 C18固相萃取柱：SepPakVacCl8”，3 mL，或相当者。427滤膜：045 pm。5仪器和设备51 高效液相色谱仪，配有荧光检测器，柱后衍生反应装置。52离心机，5 000 rrain。53固相萃取装置。54旋涡振荡器。55恒温水浴锅。56超滤离心管，分子质量10 000：Millipore YM一10”，05 mL，或相当者。6试样制备与保存61试
9、样制备从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约500 g，充分捣碎均匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记。在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。1)Sep-PakVac C，s固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2)Millipore YM 10超滤离心管是Millipore公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2GBT 232152
10、00862试样保存试样置于一18以下避光保存。7测定步骤71提取准确称取5 g试样，精确至001 g，于15 mL具塞离心管中，加人10 mL 01molL盐酸溶液(418)，振荡均匀。将离心管置于100的沸水浴中，加热5 min，冷却后，以5 000 rmin离心10min。72净化C，s固相萃取柱(426)使用前依次用60 mL甲醇和60 mL水活化，将71离心得到的上清液过柱，收集流出液，用水定容至10 mL。取约1 mL收集液，于分子质量10 000的超滤离心管(56)中离心，滤液供液相色谱测定。73测定条件731液相色谱参考条件a)色谱柱：Inertsil C83(250 mmX46
11、 mm，5 pm)，或相当者。b)色谱柱温度：30。c)流动相：流动相A(422)，流动相B(423)，流动相c：乙腈(42)。d)流动相时间梯度，见表1。表1流动相时间梯度时间min 流动相A 流动相B蹦 流动相c 流速(mLmin)0 lOO O 0 10200 100 0 0 1O205 O 935 65 0 9450 0 93 5 65 09455 100 0 O 1060O 100 0 0 10e)柱后衍生：氧化液(424)，中和液(425)，反应温度：50，反应液流速梯度见表2。表2 柱后衍生反应液流速梯度 单位为毫升每分钟时 间反应液0 min 25min 255min 45 r
12、ain 455 rain 60min氧化液 04 O4 08 08 04 04中和液 04 04 08 08 0 4 04f)荧光检测：激发波长330 nm，发射波长390 nm。g)进样量：10 pL。732色谱测定根据样液中麻痹性贝类毒素的含量情况，选定峰面积相近的标准工作液。标准工作液和样液中麻痹性贝类毒素的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，标准物质的液相色谱图参见图A1。733空白试验除不加试样外，均按上述测定步骤进行。734平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。3GBT 232152008735回收率试验阴性样品中添加标
13、准溶液，按71和72操作，测定后计算样品添加的回收率。本标准中10种麻痹性贝类毒素添加浓度及其回收率范围的试验数据参见表B1。8结果计算和表述81结果计算样品中各种麻痹性贝类毒素的含量按式(1)计算。xc署獬 (1)， UUU式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；V样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。82毒性转换按照国际惯例，STX毒素的毒性因子设为1，其他各种麻痹性毒素按照相对于STX的毒性大小来确定毒性因子(如表3所列)；样品中麻
14、痹性贝类毒素的含量则按照毒性因子，统一转换为STXeq来表示，计算公式见式(2)：STXeq一X。q式中：x，各种麻痹性贝类毒素的含量，单位为微克每千克(pgkg)r。毒性因子。表3各种麻痹性贝类毒素的毒性因子(2)毒素 GTXl GTX4 GTX2 GTX3 deGTX2 deGTX3 B1(GTX5) neoSTX STX deSTXl毒性因子 099 073 036 064 065 075 006 092 1 0519精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独
15、立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，元贝和扇贝中10种麻痹性贝类毒素的添加浓度范围及重复性方程见表4。表4 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 样品基质 重复性限r 再现性限R元贝 lgr 0850 0 lgm一0818 8 lgR-0859 1 lgm一0608 8GTX4 167167扇贝 19r一0853 9 Igm一0900 2 lgR-0729 3 lg仇一0506 7元贝 lgr 1130 6Igm 1443 lgR=O897 2 lgm一0752 8GTXl 507507扇贝 lgr=0 969 lgm一1186 7 lgR=0719 6
16、 19m-u0 528 6GBT 232152008表4(续) 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 样品基质 重复性限r 再现性限R元贝 lgr=1154 6 lgm一1172 6 lgRO964 6 19m0816 3dcGTX3 4848扇贝 lgr=139Z 7 lgm t725 3 lgR=0932 3 19m一0964 8元贝 lgr=0831 5 lgmO642 5 lgR=0817 4 lgm一0514 7B1 319319扇贝 lgr=0901 6 190 892 9 lgR=0706 8 lgm一0472 9元贝 lgr=0931 2 lgm一0830 4 IgR-08
17、57 3 19m0639 1dcGTX2 173173扇贝 lgr=0886 8 lgm一0794 3 lgR=0726 2 lgmO425 3元贝 Igr=0922 lgm一0796 2 lgR一0933 6 lgm一0788 1GTX3 6565扇贝 gr=0892 7 Igm一0766 l IgR一0841 5 Igm一0555 4元贝 lgr=0912 9 190 869 19R-1163 6 igm一1177GTX2 196196扇贝 lgr一0855 4 lgm一0802 lgR=0688 4 lgm一0412 2元贝 lgr=0844 1 lgm一0577 7 gR=0839 4
18、 lgmO540 5neoSTX 157157扇贝 lgr=0653 5 lgm一0234 2 lgR=0702 lgm一0329 4元贝 lgr=0904 2 lgm 0816 3 lgR=0858 5gm一0652 3dcSTX 12S125扇贝 【gr=0 743 5 lg优一0529 9 IgRm0755 2 lgm一0435 5元贝 g，xO 813 2 lgm一0660 9 lgR=0621 1 lg卅一O310 5STX 145145扇贝 lgr=0 907 9 lg哪一0。835 1 lgR=0734 6 lgmO450 3注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限
19、，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，元贝和扇贝中10种麻痹性贝类毒素的添加浓度范围及再现性方程见表4。GBT 232152008附录A(资料性附录)标准物质液相色谱图10种麻痹性贝类毒素标准物质液相色谱图见图A1。mV13 4儿 l M 一U、。一1GTX4：2GTXl：3dcGTX3：4 B1：5dcGTX2：6GTX3：7GTX2：8一-neoSTX：9dcSTX：10STX。图A1 10种麻痹性贝类毒素标准物质液相色谱图GBT 232152008附录B(资料性附录)回收率本标准中10种麻痹性贝类毒素添加
20、浓度及其回收率范围的试验数据见表B1。表B1 10种麻痹性贝类毒素添加浓度及其回收率范围的试验数据项目 添加 回收率范围 添加 回收率范围 添加 回收率范围 添加 回收率范围水平 水平 水平 水平名称(tlgkg) 元贝 扇贝 (tlgkg) 元贝 扇贝 (tlgkg) 元贝 扇贝 (pgkg) 元贝 扇贝737 766 757 805 82 7 80 5 766 766GTX4 167 334 100 167958 934 943 97 3 885 863 928 934807 801 801 795 783 806 80S 805GTXl 507 101 304 507923 913 86
21、1 86 7 878 872 913 91 3794 817 822 832 792 82 6 76 0 760DcGTX3 48 9 60 288 48954 90 6 874 885 93 1 92 4 954 95 4809 781 798 798 817 82 2 781 781B1 319 638 1 91 319893 90 3 862 86 7 86 9 864 90 3 90368 8 694 775 789 75 0 76 4 723 723DcGTX2 173 346 104 17398。3 942 983 925 842 83 7 942 94271 5 717 745
22、754 713 731 752 752GTX3 65 1 30 390 65974 96 2 1038 969 949 936 974 97 4781 760 753 750 791 795 760 760GTX2 196 392 118 196949 918 946 918 877 878 898 918624 675 717 723 780 780 783 758rleoSTX 157 314 942 157968 975 949 962 894 902 1006 955784- 728 792 752 789 760 772 728deSTX 125 250 750 125960 960 960 932 957 949 960 960745 752 752 762 785 756 752 752STX 145 290 870 145966 966 966 934 920 877 938 966807 818 835 825 811 826 826 820STXe口 125 250 750 1 250899 883 880 878 860 854 885 884
