1、ICS 71. 100.70 Y 42 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 27577-2011 化妆品中维生素B5(泛酸)及维生素原B5(D-泛醇)的测定高效液相色谱紫外检测法和高效液相色谱串联质谱法Determnation of vitamin Bs (pantothenic acid) and provitamin Bs ()-fantothenol) in cosmetics-HPLC/UV and HPLC MS/MS 2011-12-05发布2012-03-01实施暂且码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局毕+中国国家标准化管理委员会。叩GB/T 27577-2011 前言本
2、标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国香料香精化妆品标准化技术委员会(SAC/TC257)归口。本标准起草单位:大连市产品质量监督检验所(国家日化产品质量监督检验中心)、上海市日用化学工业研究所(国家香料香精化妆品质量监督检验中心)、大连标准检测技术研究中心。本标准主要起草人:毛希琴、胡侠、潘炜、郑顺利、李鹏、李琼。I 1 范围化妆品中维生素Bs(泛酸)及维生素原Bs(D-泛醇)的测定高效液相色谱紫外检测法和高效液相色谱串联质谱法GB/T 27577-2011 本标准规定了化妆品中维生素民(泛酸及维生素原Bs(D-泛醇)测定的高效液相色谱紫外检测法和高效液相色谱串联质谱
3、法两种方法。本标准适用于化妆品中维生素Bs(泛酸)及维生素原Bs(D-泛醇)的定量测定，高效液相色谱紫外检测法对泛酸、D泛醇的检出限为30g/g，定量限为100g/go高效液相色谱串联质谱法对泛酸、b泛醇的检出限为30ng/g;定量限为100ng/g。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6379. 1 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分:总则与定义GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确定标准测量方
4、法重复性与再现性的基本方法GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理在水和与水不互溶的有机溶剂(如三氯甲:皖或异辛烧等)形成的双液相体系中，维生素Bs(泛酸及其盐类(如泛酸铀及泛酸钙)和维生素原Bs(D-泛醇)均分布于水相，化妆品中油溶性成分易溶于有机相，而化妆品中的表面活性剂则富集于油水界面处。利用双液相体系可将维生素民和维生素原民与化妆品中油溶性成分及表面活性剂初步分离，亚铁氧化饵-醋酸辞共沉淀剂去除提取液中的大分子基质。在酸性条件下将泛酸和D泛醇富集于固相萃取C18固定相上，脱除其他水溶性干扰物后，用40%甲醇水溶液洗脱，用反相高效液相色谱分离，紫外检测器或串联网级杆质谱检
5、测，标准曲线外标法定量。4 试剂和材料除非另有说明，所用水为GB/T6682中规定的一级水。4. 1 标准物质英文名称、CAS号、分子式、分子结构式、相对分子质量、纯度见表104.2 甲醇:色谱纯。4.3 甲醇:分析纯。4.4 甲酸:分析纯。4.5 甲酸:色谱纯。1 GB/T 27577-2011 表1标准物质英文名称、CAS号、分子式、分子结构式、相对分子质量、纯度化合物英文名称CAS号分子式分子结构式相对分子纯度名称质量泛酸pantothenic acid 79-83-4 C.H17N05 H忡气219.23 。泛酸销sodium pantothenate 867-81-2 C.HI6 N
6、Na05 皿今II气t24 1. 22 99% 泛酸钙calcium pantothenat D-泛醇D-panthenol 4.6 三氯甲烧:分析纯。4. 7 乙酸丁醋:分析纯。4.8 异辛皖:分析纯。137-08-6 81-13-0 C18 H32 CaN2 010 lI3Jjpyff C.H1.NO, HO 为f4. 9 o. 2 mol/L甲酸:移取3.8mL甲酸(4.4)，用水稀释定容至500mL。4. 10 0.1 mol/L甲酸t移取1.9 mL甲酸(1.心，用水稀释定容至500mL。476.53 205.25 4. 11 醋酸钵溶液z称取21.9 g C4H604Zn .2H2
7、0(分析纯)，用0.2mol/L甲酸(4.9)溶解并定容至100 mL。4.12 亚铁氧化饵溶液:称取10.6g K4Fe(CN)6 .3H20(分析纯)，用水溶解并定容至100r。4. 13 乙酸丁醋-三氯甲皖棍合溶剂:乙酸丁醋(4.7):三氯甲:皖(4.6)体积比(1十1)。4.14 40%甲醇水溶液:甲醇(4.3):蒸馆水体积比(2十3)。4.15 CI8固相萃取小柱:200mg/3 mL，使用前，依次用3mL甲醇(4.3)、3mL蒸馆水进行活化。4. 16 一次性针式样品过滤器:0.2m，尼龙膜。4.17 标准储备溶液:分别准确称取标准物质泛酸1.0 g(或1.1g泛酸铀或者泛酸钙，折
8、合为泛酸1. 0 g)和b泛醇1.0 g(以上质量均精确至0.1mg)，用蒸馆水溶解定容至25mL，配置成浓度为40 mg/mL的标准储备液于4oC6 oC条件下保存。4.18 系列标准溶液A.首先将泛酸和D泛醇标准储备液(4.17)等体积混合配置成泛酸和b泛醇浓度均为20mg/mL的溶液，然后用蒸馆水稀释配置成泛酸和泛醇浓度均分别为1g/mL、10g/mL、50g/mL、100g/mL、200g/mL、400g/mL、800g/mL、1000g/mL的系列标准混合溶液于40C6.C条件下保存(适用于高效液相色谱紫外检测法)。4.19 系列标准溶液B.用蒸馆水稀释泛酸和D泛醇浓度均为100g/
9、mL的标准溶液(4.18)，配置成泛酸和D泛醇浓度均分别为1g/L、10g/L、50g/L、100g/L、200g/L、400g/L、800g/L和1 000g/L的系列标准溶液于4.C6 .C条件下保存(适用于高效液相色谱串联质谱法)。5 仪器和设备5. 1 高效液相色谱仪紫外检测器(高效液相色谱紫外检测法)。5.2 高效液相色谱仪串联四级杆质谱(ESI摞)(高效液相色谱串联质谱法)。5.3 分析天平z感量0.1mg ,O. 01 mg。5.4 氮吹仪。5.5 璇涡混合器。5.6 超声波清洗器。5.7 离心机z转速不小于5000 r/min，离心试管容量15mLo 5.8 移液枪或移液器。6
10、 试样制备6. 1 化妆水、乳液、中性及弱油性音霜等水易分散的化妆品样品的制备G/T 27577-2011 称取0.2g样品(精确至0.01g)于15mL具塞塑料离心管中，50oC条件下氮吹，尽量除去样品中的水分。向离心管中加入3.6 mL O. 1 mol/L甲酸(4.10)及200L醋酸辞溶液(4.11)，涡旋混合使样品均匀分散，然后向溶液中准确添加200L亚铁氧化饵溶液(4.12)，震荡摇匀，向离心管中加入3mL三氯甲烧(4.6)，涡旋混合2min，然后于5000 r/min离心5min20 mino 准确移取2mL上层溶液过Cl8固相萃取小柱(4.1日，1mL 0.1 mol/L甲酸(
11、4.10)淋洗柱床后，在小柱出口处放置2mL小试剂瓶，准确添加1mL 40%甲醇水溶液(4.14)淋洗柱床，收集流出溶液，涡旋混合，待测。6.2 油性吾霜、油剂类化妆品等水不易分散的化妆品样品的制备称取0.2g样品(精确至0.01g)于15mL具塞塑料离心管中，先向离心管中加入2mL三氯甲烧(4.肘，涡旋混合至样品均匀分散后，再向离心管中准确加入3.6 mL O. 1 mol/L甲酸(4.10)及200L醋酸辞溶液(4.11)，涡旋混合2min后，继续向离心管中准确加入200L亚铁氧化饵溶液(4.12)，涡旋混合后，于5000 r/min离心5min20 min。余下步骤与6.1相同。6.3
12、唇膏、唇彩、发蜡等蜡基化妆品样品的制备称取0.2g样品(精确至O.01 g)于15mL具塞塑料离心管中，向离心管中加入2r异辛烧(4.8) ，涡旋，若样品不能够完全分散，需将离心管置于80oC水浴中5min，待样品完全融化后，向离心管中准确加入3.6 mL O. 1 mol/L甲酸(4.10)(80 oC水浴预热)及200L醋酸辞溶液(4.11)，涡旋1 min后，将离心管重新置于800C水浴平衡5min，取出再涡旋1min。待冷却后，向溶液中准确添加200L亚铁氧化伺溶液(4.12)及2mL三氯甲:皖(4.的，震荡摇匀，必要时于5000 r/min离心5min 20 mino若样品能够完全分
13、散，则元需水浴加热，直接向离心管中准确加入3.6 mL o. 1 mol/L甲酸(4.10) (80 oC水浴预热)及200L醋酸钵溶液(4.11)，涡旋2min，然后向溶液中准确添加200L亚铁氟化饵溶液(4.12)，涡旋混合。必要时于5000 r/min离心5min20 mino 余下步骤与6.1相同。6.4 指甲油样品的制备称取0.2g样品(精确至0.01g)于15mL具塞塑料离心管中，向离心管中加入2mL乙酸丁醋-三G/T 27577-2011 氯甲皖混合溶剂(4.13)，涡旋混合至样品完全溶解并均匀分散，再向离心管中准确加入3.6mL 0.1 mol/L甲酸(4.10)及200L醋酸
14、辞溶液(4.11)，涡旋混合2min后，再向溶液中准确添加200L亚铁氧化伺溶液(4.12)，涡旋混合。必要时于5000 r/min离心5min20 mino 余下步骤与6.1相同。7 分析步骤7. 1 高效液相色谱紫外检测法7. 1. 1 班相色谱分析参考条件以下为液相色谱参考条件:a) 色谱柱:BonusRP(或相当者)，1.8m，3mmX100 mm; b) 柱温:室温;c) 流动相A:2%甲醇水溶液(含0.05%甲酸);流动相B:40%甲醇水溶液(含0.05%甲酸); d) 流速:0.3tnL/min; e) 检测波长:200nm; f) 进样量:5L;g) 液相色谱分离条件见表20表
15、2液相色谱分离条件时间流速流动相A流动相B口llnmL/min % % 。o. 3 100 。15 O. 3 100 。15.1 0.3 。100 20 0.3 。100 20. 1 0.3 100 。30 0.3 100 。注1:若上述液相色谱条件下遇到干扰，可改用2%甲酶水溶液含0.05%乙酸为A相重新进行测试。B相相应改为40%甲醇水溶液(含0.05%乙酸)，相应流动相切换时间也需根据情况进行调整。注2:柱的内径和长度及色谱填料粒径可根据色谱分离情况自由选择。注3:泛酸和1).泛酶的最大吸收均在波长195nm附近，为尽量避免流动相紫外吸收的干扰，确定检测波长为200 nmo 7. 1.
16、2 定性分析将在相同的液相色谱条件下获得的样品溶液的液相色谱分离谱图与标准物质的液相色谱分离谱图进行比较，若样品谱图中存在保留时间与某标准物质的保留时间一致的色谱峰，并且其扣除背景后的紫外吸收图谱与该标准物质的紫外吸收图谱一致，则可确认样品中存在该物质。甲酸为流动相酸性改性剂及乙酸为流动相酸性改性剂的标准物质的液相色谱分离谱图分别参见附录A中的图A.1及图A.2，标准物质紫外吸收光谱谱图参见附录A中的图A.3，实际样品液相色谱分离谱图(甲酸为流动相酸性改性剂)参见附录B中的图B.L4 GB/T 27577-2011 7.1.3 定量测定移取系列标准溶液A(4.18)，注入高效液相色谱仪中进行测
17、定，以色谱峰的峰面积对目标化合物的浓度制作标准曲线。样品溶液中维生素Bs(以泛酸计)与维生素原Bs(D-泛醇)的含量，用标准曲线外标法确定。化妆品样品中维生素Bs(以泛酸计)与维生素原Bs(D-泛醇)的含量则按式(1)进行计算。式中zcXV叉x=一一一一X10-. z X 样品中目标物的含量，单位为毫克每克(mg/g); c 从标准曲线中计算出的样品蓓液中目标物的质量浓度，单位为微克每毫升(g/mL); V 按稀释倍数折算的被测样液总体积，单位为毫升(mL);m 称取样品的质量，单位为克(g)。计算结果表示到小数点后一位。7. 1. 4 精密度. ( 1 ) 本标准的精密度数据是按照GB/T6
18、379.1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。乳液类、沐浴液类化妆品中泛酸和D泛醇测定的重复性标准差以及再现性标准差的值参见附录C中的表C.1，要求在重复性和再现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值，不超过根据附录C中的表C.1确定的重复性标准差和再现性标准差。对其他类化妆品中泛酸和D泛醇测定，要求在重复性和再现性条件F获得的两次独立测试结果的绝对差值，不超过将两次测试结果的算术平均值带入乳液类与沐浴液类化妆品的重复性标准差方程和再现性标准差方程所获得的最大值。7.2 高效渣相色谱串联质谱法7.2. 1 色谱分离参考条件以下为色谱分离参考条件:a)
19、 色谱柱:BonusRPC或相当者)，1.8m，3mmX100 mm; b) 柱温z室温;c) 流动相:20%甲醇水溶液(含0.1%甲酸hd) 流速:0.2mL/min; e) 进样量:2L。注:柱的内径和长度及色谱填料粒径可根据色谱分离情况自由选择。7.2.2 质谱参考条件以下为质谱参考条件:a) 电离方式:电喷雾电离，正离子模式，ESI(十); b) 雾化气:氮气，241kPa(35 Psi); c) 干燥气:氯气，流速10L/min，温度:350DC; d) 碰撞气:氮气;e) 毛细管电压:3500V; f) 检测方式z多反应监测(MRM);g) 其他质谱条件见表3D5 G/T 2757
20、7-2011 表3泛酸和b泛醇质谱分析参考参数项目泛酸D泛醇母离子220.2 206. 1 碎裂电压90 100 定量子离子(碰撞电压90.1 (10) 76. 1 (10) 定性子离子1(碰撞电压202. 1(6) 188.0(8) 定性子离子2(碰撞电压)184.0(8) 170.1(10) 7.2.3 定性分析在同一色谱/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与某标准物质色谱峰的保留时间一致，所选择的三对子离子的质荷比也一致，而且样品定性离子的相对丰度与浓度相当标准工作溶液的定性离子的相对丰度相比较，相对偏差不超过表4规定的范围，则可判定样品中存在该
21、物质。标准物质总离子流质谱图和提取离子(定量)质谱图见附录A中的图A.40相对离子丰度允许的相对偏差7.2.4 定量测定表4定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差50 2050 1020 土20土25土30以%表示10 土50移取系列标准溶液B(4.19)，注人高效液相色谱串联质谱仪中进行测定，以色谱峰的峰面积对目标化合物的浓度制作标准曲线。样品溶液中维生素B5(以泛酸计)与维生素原B5(D-泛醇)的含量，用标准曲线外标法确定。化妆品样品中维生素B5(以泛酸计)与维生素原B5(D-泛醇)的含量则按式(2)进行计算(如果所测样品溶液中泛酸或D泛醇的浓度大于1g/g，应对待测样品溶液进行适当的稀释后
22、重新进行测定)。式中:c X V , A- x=一-一一X10-3 1 X一一样品中目标物的含量，单位为微克每克(g/g);c -一一从标准曲线中计算出的样品溶液中目标物的质量浓度，单位为微克每升(g/L); V一一按稀释倍数折算的被测样液总体积，单位为毫升(mL);m一一称取样品的质量，单位为克(g)。计算结果表示到小数点后一位。7.2.5 精密度. ( 2 ) 本标准的精密度数据是按照GB/T6379. 1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。指甲油类化妆品、唇音类化妆品中泛酸和D泛醇测定的重复性标准差以及再现性标准差的值参见附录C中的表C.1，要求
23、在重复性和再现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值，不超过根据附GB/T 27577-2011 录C中的表C.l确定的重复性标准差和再现性标准差。对其他类化妆品中泛酸和D泛醇测定，要求在重复性和再现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值，不超过将两次测试结果的算术平均值带人指甲油类与唇膏类化妆品的重复性标准差方程和再现性标准差方程所获得的最大值。7 GB/T 27577-20门附录A(资料性附录)标准物质液相色谱分离谱图、紫外吸收光谱谱图、总离子流质谱图和提取商子(定量)质谱圄标准物质液相色谱分离谱图、紫外吸收光谱谱图、总离子流质谱图和提取离子(定量)质谱图见图A.l图A.4。D一泛醇泛
24、酸t/min o 2 4 6 8 10 12 14 16 图A.l标准物质液相色i昔分离谱图(甲酸为流动相酸性改性剂)D一泛E事泛酸。5 10 15 20 25 t/min 30 固A.2标准物质液相色谙分离谱图(乙酸为流动相酸性政性剂)D泛醇泛酸190 240 290 340 m n , A nu nu3 qd 图A.3标准物质紫外眼收光谱谱图8 GB/T 27577-2011 +TIC(总离子流质谱图)+MRM (206. 1 16. 1) +(220.290. 1) 。2 3 4 5 6t/min 图A.4标准物质总离子流质谱图和提取离子(定量)质谱图9 GB/T 27577-2011
25、附录B(资料性附录)实际样晶液相色谱分离谱图实际样品液相色谱分离谱图见图B.l。2 4 6 8 10 12 14 16 t/min 图B.1实际样品渡相色谱分离谱图(甲酸为流动相酸性改性剂)10 G/T 27577-2011 附录C(资料性附录)不同基质化妆品中泛酸与B泛醇测定的重复性标准差和再现性标准差不同基质化妆品中泛酸与D泛醇测定的重复性标准差和再现性标准差见表C.L表C.1不同基质化妆品中泛酸与b泛醇测定的重复性标准差和再现性标准差D-泛蹲泛酸采用方法样品含量范围重复性标准差再现性标准差名称重复性标准差再现性标准差(5,) (5R) (5,) (5R) 5, =0.082 32m+ 5
26、R =0.128 8m+ 5, =0.09856m+ 5R =0.127 68m+ 沐浴液0.012 6 0.016 8 0.015 12 0.024 36 液相色谱紫外0.1 mg/g 检测法10 mg/g 5,=0.063 28m+ 5R =0.097 16m+ 5, =0.06748m+ 5R =0.101 08m+ 乳液0.004 2 0.006 72 0.016 8 0.021 56 唇ff5，=0.08904m十5R =0.142 52m十5,=0.10388m+ 5R =0.130 2m十液相色谱串联0.1g/g 0.018 2 0.050 4 0.006 72 0.028 28
27、 质谱法10g/g 5, =0.071 12m+ 5R=0.1386m十5,=0.08176m+ 5R =0.145 6m+ 指甲泊0.009 52 0.013 44 0.014 28 0.029 96 一一一FEN-hhmhNHS 华人民共和国家标准化妆晶中维生素B5(泛酸)及维生素原B5(D-泛醇)的测定高效液相色i营紫外检测法和高效液相色谱串联质谱法GB/T 27577-2011 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤开本880X12301/16 印张1字数23千字2012年2月第一版2012年2月第一次印刷唔书号:155066. 1-44155 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 27577-2011 打印忖WJ:2012年3月8H F002A
