1、GB/T 18932.14-2003 前言GB/T 18932的本部分修改采用加拿大标准ACC-060-Vl. 2高效液相色谱荧光检测法测定蜂蜜中苯甲1m含量)，修改的主要内容是g流动相由甲醇十水改为乙腊+水。本部分的附录A和附录B为资料性附录。本部分由国家质量监督检验检疫总局提出.本部分由中华全国供销合作总社归口。本部分起草单位z中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本部分主要起草人s庞国芳、张进杰、曹彦忠、李学民、范春林、郭彤彤.本部分系首次发布的国家标准。I GB/T 18932.14-2003 1 范围蜂蜜中苯甲醒残留量的测定方法液相色谱-荧光检测法GB/T 18932的本部分规定了蜂
2、蜜中苯甲隆残留量的高效液相色谱荧光检测方法。本部分适用于蜂蜜中苯甲M残留量的测定，本部分苯甲霞的方法检出限为0.012mg/烛。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6379测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性(GB/T 6379一1986.neq ISO 5725 ,1981) GB/T 6682 分析实
3、验室用水规格和试验方法(GB/T6682-1992 .neq ISO 3696 , 1987) 3 原理试样中苯甲隆残留在过量钱离子存在的条件下与1.3环己二酶反应生成荧光衍生物。样液过滤后用C18色谱柱分离，高效液相色谱荧光检测器测定。4 试剂和材料除另有说明外，所用试剂为分析纯，试验用水为符合GB/T6682规定的一级水.4. 1 甲薛2色谱纯。4.2 20 %甲醇溶液g用甲醇(4.1)和水按体积比0+4)配制。4.3 乙腊z色谱纯。4.4 浓盐酸z优级纯。4.5 乙酸镀s优级纯.4.6 1.3环己二酬z含量大于97% 4. 7 C18固相萃取柱，2000mg. 12 mL. 4.8 苯甲
4、醒标准物质=纯度大于99%.4.9 苯甲醒标准储备液称取适量苯甲醒标准物质(4.8)J100 mL容量瓶，用甲醇溶解，并稀择至刻度。储备液浓度为1000g/mL.放人4C冰箱中保存。4. 10 苯甲M标准工作溶液.吸取适量苯甲醒标准储备液(4.引用20%甲醇水溶液(4.2)稀释为10g/mL标准工作溶液。4. 11 苯甲隆标准校准溶液2吸取适量的苯甲醒标准工作溶液(4.10).用20%甲醇水溶液分别配制成0.012g/mL.0.024g/mL.0.12g/mL.0.25g/mL.0.50g/mL的标准校准溶液。4. 12 冰水浴=将冰块捣碎放入500mL烧杯中与水混合。4. 13 具塞比色管，
5、10mL.25 mL. l GB/T 18932.14-2003 4. 14 针管式过滤器滤头:0.45m。4. 15 玻璃固相萃取装置。4. 16 衍生剂4. 16. 1 衍生剂的制备g称取25g乙酸镀(4.5)和2g 1，3环己二酣(4.6)于150mL三角瓶中，加入50 mL水，在磁力搅拌器上搅拌使其完全溶解。然后边搅拌边缓慢加入8mL浓盐酸(4.心，再搅拌5ffiln，使浓盐酸溶解时产生的自烟散尽。转人100mL容量瓶中并用水稀释到刻度。4. 16. 2 衍生剂的提纯z将初制备的衍生剂(4.16.1)转入4支25mL具塞比色管(4.13)中，盖好塞子放人60C热水浴中60miflc取出
6、比色管并放入冰水浴(4.12)中30min。把一个C18固相萃取柱(4.7) 连接到玻璃固相萃取装置(4.15)上，用10mL甲醇和20mL水预处理萃取柱，再用5mL初制备的衍生剂洗涤萃取柱，弃去全部淋出液。用真空泵控制淋洗流速为每秒钟2滴，使初制备的衍生剂通过萃取柱，用干净的200mL平底烧瓶接收提纯的衍生剂。衍生剂需当天制备，从ftjIJ备到使用一般不应超过24h。如果衍生剂放置时间太长，会明显降低衍生效率。5 仪器5. 1 高效液相色谱仪配有荧光检测器。5.2 真空泵。5.3 pH计测量精度士0.0205.4 液体混匀器。5.5 磁力搅拌器。5.6 微量进祥器225L.100L。5.7
7、天平z精确到0.1go 6 试样的制备与保存6. 1 试样的制备实验室样品，将其搅拌均匀。不得加热。制备好的试样置于样品瓶中密封，并做上标记。6.2 试样的保存将试样子常温下保存。7 分析步骤7. 1 样晶的提取称取10g蜂蜜样品(精确j1JO. 1 g)置于100mL三角瓶中，加入10mL甲醇，在液体混匀器上高速混合并放置30min以上。转入50mL容量瓶中，用水洗涤三角瓶，并人容量瓶中，再用水稀释至J度。混合均匀后为样品提取溶液。7.2 样晶提取液的衍生准确吸取0.5mL样品提取溶液(7.1)置于10mL具塞比色管中，加入1mL提纯的衍生剂(4.16.2)盖好塞子，混合均匀，放人60C热水
8、浴中反应2.5ho取出比色管放人冰水浴中30min，然后放置到室温。衍生溶液用O.45m滤膜过滤到5mL费j度离心管中，待测。7.3 测定7. 3. 1 液相色谱条件2 a) 色谱柱:Diamonsil C18 5m. 250 mmX4. 6 mm(内径)或相当者sb) 流动相z乙腊十水(30+70); d 流动相流速:1. 0 mL/min; d) 检测器波长:激发波长380nm，发射波长450nm; e) 色谱柱温度，30C，1) 进样量280L.7.3.2 色谱测定GB/T 18932. 14-2003 根据样品溶液中苯甲残留量，选择峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样品溶液中苯甲醒
9、响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品溶液等体积参插进样进行测定。在上述色谱条件下，苯甲腔的参考保留时间约为16min.苯甲隆标准物质的色谱图参见附录A中的图A.1. 7.4 平行试验按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.5 空臼试验不称取蜂蜜样品，以20%甲醇水溶液作为空白样品按上述步骤操作。7.6 标准溶液测定苯甲座标准校准溶液(4.11)，按上述步骤操作。8 结果计算结果按式()计算:式中x h c V 1 000 二.一h飞m 1 000 X 试样中苯甲醒的残留含量，单位为毫克每千克(mg/kg);h一样品溶液中苯甲醒的峰高，单位为毫米(mm); h, 标准溶液中苯
10、甲酸的峰高，单位为毫米(mm); c 标准溶液中苯甲醒的浓度，单位为微克每毫升(vg!mL); V 样品溶液最终定容体积.单位为毫升(mL); m 最终样品溶液所代表的试样质量，单位为克(g)。注.计算结果需将空白值扣除。9 精密度. ( 1 ) 本部分精密度数据是按照GB/T6379的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度计算。9. 1 重复性在重复性条件下，蜂蜜中苯甲醒的含量在O.060 mg/kgO. 50 mg/kg时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(吵，本部分的重复性限按方程式(2)计算19r 1.055 llgm- O. 9676 . ( 2 ) 式中:m一
11、两次测定值的平均值，单位为毫克每千克(mg/kg)。如果差值超过重复性限，成舍弃民验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2 再现性在再现惊条件下，蜂蜜中苯甲酶的含量在O.060 mg/kgO. 50 mg/kg时.获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，卒部分再现性限按方程式(纠计算:IgR = 0.9580 19m - 0.921 4 -. ( 3 ) 式中捆二两次测定值的平均值，单位为毫克每于克(mg/kg)。3 附录(资料性附录标准物质色谱回A GB月18932.14-2003四.四四苯甲醒标准物质液相色谱图，见图A.l.圄A.1 注s苯甲霞的保留时间为16.027miDe 4 附豪B(资料性附亵固收率本方法中苯甲隆添加浓度和平均回收率的数据如下g在添加量为0.060mg/kg时，平均回收率为90.3%, 在添加量为0.12mg/同时，平均回收率为88.4%; 在添加量为0.60mg/同时，平均回收率为96.7%, 在添加量为1.20 mg/同时，平均回收率为97.6%.GB/T 18932.14-2003 5
