1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5223 2019 蜂蜜中 18 种游离氨基酸的测定 高效液相色谱 - 荧光检测法 Determination of 18 free amino acids in honey null HPLC-FLD method 2019-12-27 发布 2020-07-01 实施 ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5223 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担
2、识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：陈辉、彭涛、代汉慧、胡雪艳、谢瑜杰、范春林。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5223 2019 蜂蜜中 18 种游离氨基酸的测定 高效液相色谱 - 荧光检测法 1 范围 本标准规定了蜂蜜中 18 种游离氨基酸的高效液相色谱 - 荧光检测方法。 本标准适用于蜂蜜天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、谷氨酰胺（Gln）、组氨酸 （His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tys）、缬氨
3、酸（Val）、 蛋氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe） 、异亮氨酸（Ileu） 、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys） 、 脯氨酸（Pro）的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 方法提要 采用定量环衍生的方法对蜂蜜中氨基酸进行衍生化处理，再用高效液相色谱 - 荧光检测法进行 测定，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的
4、一级水。 4.1 磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 2H 2 O ）。 4.2 氢氧化钠（NaOH）。 4.3 硼酸（BH 3 O 3 ）。 4.4 乙腈（色谱纯）。 4.5 甲醇（色谱纯）。 4.6 浓盐酸。 4.7 邻苯二甲醛试剂（OPA）：10 mg/mL。 4.8 9- 芴甲基氯甲酸酯试剂（FMOC）：2.5mg/mL。 4.9 氢氧化钠溶液（10mol/L）：称取 40 g 氢氧化钠（4.2），溶于 50 mL 水中，冷却至室温后，用水 稀释至 100 mL，混匀。 4.10 0.1 mol/L 盐酸溶液：取 0.90 mL 浓盐酸（4.6）至 100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度
5、，混匀。 4.11 硼酸盐缓冲液：称取 2.47 g 硼酸（4.3）于 100 mL 水中，用氢氧化钠溶液（4.9）调节 pH 值至 10.2。 4.12 磷酸二氢钠缓冲溶液：称取 6.24 g 磷酸二氢钠（4.1），转移到 1 000 mL 玻璃烧杯中。加入 1 000 mL 超纯水，搅拌，直到所有晶体完全溶解。用氢氧化钠溶液（4.9）调节溶液 pH 值至 7.80。 4.13 18 种单个氨基酸标准品（具体名称参见附录 A）：固体，纯度不小于 98%。 4.14 混合氨基酸标准储备溶液：准确称取一定量的各种氨基酸标准品，用0.1 mol/L盐酸溶液（4.10） 以正式出版文本为准 2 SN
6、/T 5223 2019 溶解，混匀，使其浓度为 500 pmol/ L。 4.15 混合氨基酸标准工作溶液：准确量取混合氨基酸标准储备溶液（4.14），用0.1 mol/L盐酸溶液（4.10） 稀释，依次配制成浓度分别为 0.5 pmol/ L、1 pmol/ L、2.5 pmol/ L、5 pmol/ L、10 pmol/ L、25 pmol/ L的 标准溶液。 4.16 微孔滤膜：孔径 0.22 m。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱仪：配有荧光检测器。 5.2 磁力搅拌器。 5.3 分析天平：感量为 0.1 mg 和 0.001 g。 5.4 pH 计。 6 测定步骤 6.1 样品准备
7、 称取 3.0 g（精确至 0.01 g）蜂蜜样品，用适量超纯水涡旋混匀至溶解，然后用超纯水定容至 25 mL， 0.22 m 滤膜过滤，上机检测。 6.2 测定 6.2.1 液相色谱参考条件 6.2.1.1 色谱柱：氨基酸分析柱，150 mm4.6 mm （内径），3.5 m 或相当者； 6.2.1.2 柱温：40 ； 6.2.1.3 自动进样器：定量环规格为 100 L。 6.2.1.4 进样器程序：参见附录 B。 6.2.1.5 流动相 A 为磷酸二氢钠缓冲溶液（4.12）。流动相 B 为乙腈 : 甲醇 : 水 =45 : 45 : 10（v/v/v）。 流动相、流速及梯度洗脱条件见表
8、1。 表 1 流动相、流速及梯度洗脱条件 时间 /min 流动相 A/% 流动相 B/% 流速/ml/min 0 100 0 2 1.9 100 0 2 18.1 43 57 2 18.6 0 100 2 22.3 0 100 2 23.2 100 0 2 26 100 0 2 以正式出版文本为准 3 SN/T 5223 2019 6.2.1.6 FLD 参数： 0 min，激发波长 =340 nm ；发射波长 =450 nm ；PTM gain=10 ； 15 min，激发波长 =266 nm ；发射波长 =305 nm ；PTM gain=9。 6.3 定性 依据氨基酸标准样品的保留时间，
9、对待测样品中各氨基酸进行定性，定性色谱图参见附录 C。 6.4 定量 本方法采用外标法定量测定。样品中氨基酸响应值应在标准工作曲线线性范围内，如果超出，应 稀释。计算时标准工作溶液中各氨基酸浓度由 pmol/ L 换算为 mg/L，相对分子质量参见附录 A。 7 结果计算和表述 试样中游离氨基酸的含量按照式（1）计算： （1） 式中： X试样中游离氨基酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； A被测样品中游离氨基酸的峰面积； b标准曲线方程的截距； k标准曲线方程的斜率； D二次稀释倍数； V样品的定容体积，单位为毫升（mL）； m试样的质量，单位为克（g）。 8 定量限 除脯氨酸定量限为
10、1.0 mg/kg 外，其余游离氨基酸的定量限为 0.2 mg/kg。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5223 2019 附 录 A （资料性附录） 18 种氨基酸的分子式和相对分子量 表 A.1 18 种氨基酸的分子式和相对分子量 序号 中文名称 英文名称 英文缩写 分子式 相对分子质量 CAS 号 1 天冬氨酸 aspartic acid Asp C 4 H 7 NO 4 133.1 1783-96-6 2 谷氨酸 glutamic acid Glu C 5 H 9 NO 4 147.13 56-86-0 3 丝氨酸 serine Ser C 3 H 7 NO 3 105.09 56-
11、45-1 4 谷氨酰胺 glutamine Gln C 5 H 10 N 2 O 3 146.14 56-85-9 5 组氨酸 histidine His C 6 H 9 N 3 O 2 155.15 71-00-1 6 甘氨酸 glycine Gly C 2 H 5 NO 2 75.07 56-40-6 7 苏氨酸 threonine Thr C 4 H 9 NO 3 119.12 72-19-5 8 精氨酸 arginine Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174.2 74-79-3 9 丙氨酸 alanine Ala C 3 H 7 NO 2 89.09 56-41-7 10
12、酪氨酸 tyrosine Tyr C 9 H 11 O 3 N 181.19 60-18-4 11 缬氨酸 valine Val C 5 H 11 NO 2 117.15 72-18-4 12 蛋氨酸 methionine Met C 5 H 11 NO 2 S 149.21 63-68-3 13 色氨酸 tryptophan Trp C 11 H 2 O 2 N 2 204.23 73-22-3 14 苯丙氨酸 phenylalanine Phe C 9 H 11 O 2 N 165.19 150-30-1 15 异亮氨酸 isoleucine Ileu C 6 H 13 NO 2 131.
13、17 73-32-5 16 亮氨酸 leucine Leu C 6 H 13 NO 2 131.17 61-90-5 17 赖氨酸 lysine Lys C 6 H 14 N 2 O 2 146.19 56-87-1 18 脯氨酸 proline Pro C 5 H 9 NO 2 115.13 147-85-3 以正式出版文本为准 5 SN/T 5223 2019 附 录 B （资料性附录） 自动进样器程序 B.1 在不同进样小瓶中分别加入适量硼酸缓冲液（小瓶 1），蜂蜜样品（由进样序列设置），水（小 瓶2，不加瓶盖），OPA试剂（小瓶3），FMOC试剂（小瓶4），水（小瓶5），其中OPA试剂
14、和 FMOC 试剂需要分装 100 L 到带有锥形内插管的进样小瓶中，分装后应立即封盖。按照表 B.1 设置自 动进样器程序。 表 B.1 自动进样器程序 序号 操作名称 参数设置 小瓶编号 1 抽取 2.5 L 小瓶 1 2 抽取 2.0 L（蜂蜜样品） 由进样序列设置 3 混合 3.0 L 空气，最大速度，2 次 4 等待 0.5 min 5 抽取 0.0 L（洗针） 小瓶 2 6 抽取 0.5 L 小瓶 3 7 混合 3.0 L 空气，最大速度，6 次 8 抽取 0.0 L（洗针） 小瓶 2 9 抽取 0.5 L 小瓶 4 10 混合 4.0 L 空气，最大速度，6 次 11 抽取 32
15、.0 L 小瓶 5 12 混合 18.0 L 空气，最大速度，2 次 13 进样 以正式出版文本为准 6 SN/T 5223 2019 附 录 C （资料性附录） 定性色谱图 说明： 1 天冬氨酸（Asp）； 2 谷氨酸（Glu）； 3 丝氨酸（Ser）； 4 谷氨酰胺（Gln）； 5 组氨酸（His）； 6 甘氨酸（Gly）； 7 苏氨酸（Thr）； 8 精氨酸（Arg）； 9 丙氨酸（Ala）； 10 酪氨酸（Tys）； 11 缬氨酸（Val）； 12 蛋氨酸（Met）； 13 色氨酸（Trp）； 14 苯丙氨酸（Phe） ； 15 异亮氨酸（Ileu） ； 16 亮氨酸（Leu） ； 1
16、7 赖氨酸（Lys） ； 18 脯氨酸（Pro） 图 C.1 标准溶液中 18 种氨基酸色谱图 以正式出版文本为准 I SN/T 5223 2019 Forward This standard was drafted in accordance with the requirements of GB/T 1.1 2009. Please note that this standard some material may be involved in patent, this standard release mechanism does not assume the responsibilit
17、y of identifying these patents. This standard was proposed by General Administration of Customs of the Peoplenulls Republic of China. This standard was drafted by Chinese Academy of Inspection and Quarantine. This standard was mainly drafted by: Chen Hui, Peng Tao, Dai Hanhui, Hu Xueyan, Xie Yujie,
18、Fan Chunlin. 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5223 2019 Determination of 18 free amino acids in honey HPLC-FLD method 1 Scope This standard specifies the testing method of 18 free amino acids in honey by high performance liquid chromatography- fluorescence detector with principle, reagents and materials,
19、qpparatus and equipment, analysis steps, calculation and expression of the result, limit of determination. This standard is applicable to the determination of the content of Aspartic acid（Asp） , Glutamic acid（Glu） , Serine（Ser） , Glutamine（Gln） , Histidine（His） , Glycine（Gly） , Threonine（Thr） , Argi
20、nine（Arg） , Alanine（Ala） , Tyrosine（Tyr） , Valine（Val） , Methionine（Met） , Tryptophan（Trp） , Phenylalanine（Phe） , Isoleucine（Ileu） , Leucine（Leu） , Lysine（Lys） , Proline（Pro） in honey. 2 Normative reference The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, c
21、onstitute provisions of this standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of any of these publications do not applied. However parties to agreements based on this standard are encouraged to investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative do
22、cuments indicated below. For undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. GB/T 6682 Water for analysis laboratory use Specification and test methods. 3 Principle Following automated in-loop pre-column derivative, the free amino acid of honey was separated by
23、high performance liquid chromatography-fluorescence detector, and quantified by the external standard curve. 4 Reagents and materials Unless specifically mentioned, all reagent used should be analytical grade, “water” is the first grade water prescribed by GB/T 6682. 4.1 Sodium dihydrogen phosphate
24、（NaH 2 PO 4 2H 2 O）. 4.2 Sodium hydroxide （NaOH）. 4.3 Boric acid （BH 3 O 3 ）. 4.4 Acetonitrile: HPLC grade. 4.5 Methanol: HPLC grade. 4.6 Hydrochloric acid （HCl）. 4.7 O-phthalaldehyde （OPA）: 10 mg/mL. 4.8 9-fluorenylmethyloxycarbonyl （FMOC）: 2.5mg/mL. 4.9 Sodium hydroxide solution: weigh 40.0 g NaOH
25、（4.2）, dissolve with ultrapure water and dilute to 100 mL. 以正式出版文本为准 2 SN/T 5223 2019 4.10 0.1 mol/L HCl solution: transfer 0.90 mL hydrochloric acid（4.6） into 100 mL volumetric flask, dissolve with water and dilute to the scale reading. 4.11 Borate buffer: weigh 2.47 g Boric acid （4.3） , dissolve w
26、ith ultrapure water and dilute to 100 mL, and then adjust the pH to 10.2 with sodium hydroxide solution （4.9） . 4.12 Sodium dihydrogen phosphate buffer: weigh 6.24 g sodium dihydrogen phosphate （4.1） , dissolve with ultrapure water and dilute to 1 000 mL, and then adjust the pH to 7.8 with sodium hy
27、droxide solution （4.9） . 4.13 18 amino acid standards （see Annex A） : solid, purities are all 98%. 4.14 Amino acid standard stock solution: accurately weigh a certain amount of amino acid standard, dissolve with 0.1mol/L hydrochloric acid（4.10） , mix adequately, the final concentration was 500 pmol/
28、 L. 4.15 Mix standard working solution: accurately transfer an adequate amount of standard stock solution（4.14） , dissolve with 0.1 mol/L hydrochloric acid（4.10） to prepare the solution concentration as 0.5 pmol/ L, 1 pmol/ L, 2.5 pmol/L, 5 pmol/L, 10 pmol/L and 25 pmol/L. 4.16 Membrane filter: 0.22
29、 m. 5 Apparatus and equipment 5.1 Liquid chromatography with fluorescence detector. 5.2 Magnetic mix. 5.3 Balance, sensitivity: 0.001 g and 0.1 mg. 5.4 pH meter. 6 Analysis steps 6.1 Sample preparation Weigh 3.0 g （accurate to 0.01 g） of honey sample, dissolve with a certain amount of ultrapure wate
30、r, make them homogeneous by mixing, dilute to 25 mL with ultrapure water, and then filtered through 0.22 m membrane. The filtrate is ready for HPLC-FLD determination. 6.2 Determination 6.2.1 LC operation reference conditions 6.2.1.1 LC column: ZORBAX Eclipse-AAA,150 mm4.6 mm （i.d.）,3.5 m,（or other c
31、onformable column） . 6.2.1.2 Column temperature: 40 . 6.2.1.3 Automatic injector: the volume of loop was 100L. 6.2.1.4 Autosampler programming: see annex B. 6.2.1.5 A is sodium dihydrogen phosphate buffer; B is acetonitrile : methanol : water=45 : 45 : 10（v/v/v） . Mobile phase, flow rate and elute c
32、ondition: see Table 1. Table 1Elute condition Time/min A/% B/% Flow rate / （ml/min） 0 100 0 2 1.9 100 0 2 18.1 43 57 2 以正式出版文本为准 3 SN/T 5223 2019 Time/min A/% B/% Flow rate / （ml/min） 18.6 0 100 2 22.3 0 100 2 23.2 100 0 2 26 100 0 2 6.2.1.6 FLD parameters: 0 min, excitation wavelength=340 nm; emiss
33、ion wavelength=450 nm; PTM gain=10; 15 min, excitation wavelength=266 nm; emission wavelength=305 nm; PTM gain=9. 6.3 Qualification Under above determination condition, the amino acids in honey sample were identified according to the retention time of amino acids in standard solution, the chromatogr
34、am of standards, see Annex C. 6.4 Quantification The method quantified by the external standard curve. The responses of free amino acids in the sample solution should be in the linear range of the instrumental detection.The concentration of amino acids in the calibration curves should be converted f
35、rom pmol/Ltomg/L, and the relative molecular mass see Annex A. 7 Calculation and expression of the result Calculate the free amino acids in the test sample according to the following formula（1）: （1） where ： Xthe content of free amino acids in the test sample, mg/kg. Apeak area of free amino acids in
36、 sample solution. bintercept of calibration curve. kslope of calibration curve. Ddilution factor. Vthe volume of sample solution, mL. mmass of test sample, g. 8 Limit of determination Determination of free amino acids under above determination conditions, the limit of determination for proline was 1
37、.0 mg/kg, and for other amino acids was 0.2 mg/kg. 续表 以正式出版文本为准 4 SN/T 5223 2019 Annex A （informative） Amolecular formula and relative molecular mass of 18 free amino acids Table A.1 Molecular formula and relative molecular mass of 18 free amino acids No. amino acid Shorthand Molecular formula Relat
38、ive molecular mass CAS No. 1 aspartic acid Asp C 4 H 7 NO 4 133.1 1783-96-6 2 glutamic acid Glu C 5 H 9 NO 4 147.13 56-86-0 3 serine Ser C 3 H 7 NO 3 105.09 56-45-1 4 glutamine Gln C 5 H 10 N 2 O 3 146.14 56-85-9 5 histidine His C 6 H 9 N 3 O 2 155.15 71-00-1 6 glycine Gly C 2 H 5 NO 2 75.07 56-40-6
39、 7 threonine Thr C 4 H 9 NO 3 119.12 72-19-5 8 arginine Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174.2 74-79-3 9 alanine Ala C 3 H 7 NO 2 89.09 56-41-7 10 tyrosine Tyr C 9 H 11 O 3 N 181.19 60-18-4 11 valine Val C 5 H 11 NO 2 117.15 72-18-4 12 methionine Met C 5 H 11 NO 2 S 149.21 63-68-3 13 tryptophan Trp C 11 H 2 O 2
40、 N 2 204.23 73-22-3 14 phenylalanine Phe C 9 H 11 O 2 N 165.19 150-30-1 15 isoleucine Ileu C 6 H 13 NO 2 131.17 73-32-5 16 leucine Leu C 6 H 13 NO 2 131.17 61-90-5 17 lysine Lys C 6 H 14 N 2 O 2 146.19 56-87-1 18 proline Pro C 5 H 9 NO 2 115.13 147-85-3 以正式出版文本为准 5 SN/T 5223 2019 Annex B （informativ
41、e） Autoinjector program A certain volumn of borate buffer （Vial 1）, honey sample （by injection sequence）, ultrapure water （vial 2, without cap）, OPA （vial 3）, FMOC （vial 4）, ultrapure water （vial 5） should be prepared. Among them, OPA and FMOC should be placed into the vial with tape change tube, an
42、d the cap should be covered immediately. The autoinjector program see Table B.1. Table B.1 Autoinjector program No. Operation parameters Vial No. 1 draw 2.5 L Vial 1 2 draw 2.0 L （sample） By injection sequence 3 mix 3.0 L in air, max speed, 2 times 4 wait 0.5 min 5 draw 0.0 L（needle wash） Vial 2 6 d
43、raw 0.5 L Vial 3 7 mix 3.0 L in air, max speed, 6 times 8 draw 0.0 L（needle wash） Vial 2 9 draw 0.5 L Vial 4 10 mix 4.0 L in air, max speed, 6 times 11 draw 32.0 L Vial 5 12 mix 18.0 L in air, max speed, 2 times 13 inject 以正式出版文本为准 6 SN/T 5223 2019 Annex C （informative） Qualification chromatography
44、Explain: 1 Aspartic acid （Asp）; 2 Glutamic acid （Glu）; 3 Serine （Ser）; 4 Glutamine （Gln）; 5 Histidine （His）; 6 Glycine （Gly）; 7 Threonine （Thr）; 8 Arginine （Arg）; 9 Alanine （Ala）; 10 Tyrosine （Tys）; 11 Valine （Val）; 12 Methionine （Met）; 13 Tryptophan （Trp）; 14 Phenylalanine （Phe）; 15 Isoleucine （Ile
45、u）; 16 Leucine （Leu）; 17 Lysine （Lys）; 18 Proline （Pro）. Figure C.1 chromatogram of 18 free amino acids in standard solution 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本 8801230 1/16 印张 1.25 字数 28 千字 2019 年 月第一版 2019 年 月第一次印刷 印数 1500 书号：155175158 定价 21.00 元 蜂蜜中 18 种游离氨基酸的测定 高效液相色谱 - 荧光检测法 行 业 标 准 SN/T 52232019 SN/T 52232019 * * * 网址 SN/T 5223 2019
