1、ICS 11. 220 B 41 道国中华人民共和国国家标准GB/T 27644-2011 禽痕殇病毒2型荧光PCR检测方法Protocol of real-time PCR for detecting Gallid Hepers Virus 2 2011-12-30发布2012-04-01实施时马脐飞/中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准禽癌密病毒2型荧光PCR检测方法GB/T 27644-2011 晤中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)6427
2、5323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销峰开本880X12301/16 印张O.75 字数17千字2012年3月第一版2012年3月第一次印刷唔书号:155066. 1-44332定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 27644-2011 目。自本标准按照GB/T1. 1-2009的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位z中华人民共和国深圳出入境检验检疫局
3、、扬州大学、河南农业大学。本标准主要起草人z詹爱军、刘文博、王新卫、卢体康、花群义、陈书珉、秦智锋、陈兵、高小博。I GB/T 27644-2011 禽癌殇病毒2型荧光PCR检测方法1 范围本标准规定了禽殖彦病毒2型荧光PCR检测的操作方法。本标准适用于禽瘤痊病毒2型的鉴定及其流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值:每个反应管内的荧光信号量达
4、到设定的阔值时所经历的循环数。DNA: deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸。dNTP: deoxy-ribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核糖核昔。含有dCTP、dGTP、dATP、dTTP四种脱氧核糖核昔。EDT A: ethy lene diaminetetraacetic acid 乙二胶四乙酸。GHV 2: Gallid Hepers Virus 2 禽殖彦病毒2型(马立克氏病病毒血清1型)。MD: Marek s Disease 马立克氏病。PBS: phosphate belanced solution 磷酸盐缓冲生理盐水。PCR:
5、 polymerase chain reaction 聚合酶链式反应。Real-time PCR: Real-time polymerase chain reaction 实时荧光聚合酶链反应。Taq酶:Thermus aquaticus polymerase 耐热DNA聚合酶。4 试剂4. 1 试剂级别:除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。4.2 禽痛痒病毒2型荧光PCR检测试剂盒，-20.C保存，组成及使用注意事项参见附录A.4.3 引物和探针序列(产物长度142bp) 上游寻|物:5 CCACCACCTCCCA TCTGT AC 3 下游
6、引物:5GACAAGGCTGAGCGTAAACC 3 TaqMan探针:5 ACACGGCTCGGT AACAGGACACAATG 3 ，其5端和3端分别标记FAM和BHQ(或Tamra或Eclipse)。4.4 1%肝素铀，配制方法见B.1，4.C保存。4.5 三氯甲烧，常温保存。1 GB/T 27644-2011 4.6 异丙晖，使用前预冷至一20c。4. 7元水乙E事。4.8 75%乙醇，采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，使用前预冷至一20.C。4.9 0.01 mol/L PBS，pH7.2，配制方法见B.2。5 器材和设备5. 1 元菌注射器，1mL , 5 mL,10 mL,25 mL
7、, 100 mL。5.2 一次性元菌塑料袋。5.3 1. 5 mL无DNA酶和RNA酶的Eppend)rf管。5.4 0.2 mL元DNA酶和RNA酶的PCR薄壁管、八联管或96孔板p5.5荧光PCR检测仪。5.6 高速台式冷冻离心机，可控温至4.C、离心速度可达12000g以上。5. 7 振荡器。5.8 研钵。5.9 普通冰箱和超低温冰箱:规格2.C8.C，一20.C，-80.C。5.10 微量移液器，0L2L，lL10L，10L100L，20L200L，100Ll000L，并配备与移液器匹配的元DNA酶和RNA酶的吸头。6 样品的采集和处理6. 1 样品的采集6. 1. 1 全血用预先加入
8、1%肝素铀的无菌注射器直接吸取全血至无菌Eppendorf管中，盖上管盖并编号。6. 1. 2 羽毛和组织脏器取待检羽毛(从根部挤出少量羽髓)、肝脏、肾脏和脾脏样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。6.2 样晶贮运样品采集后，放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品，放一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密封，送实验室。6.3 样晶处理6.3. 1 全血3000g离心30min，取棕黄色层转入元菌的1.5 mL Eppendorf管中，加人500LPBS洗涤，3000g离心15min，弃上清，编号备用。6.3.2 现毛或组织脏器取待检样品2.0g加入2mL pH7. 2的O.01 mol/
9、L PBS于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，分装编号备用。2 GB/T 27644-2011 6.4 样本存放制备的样本在2oC8 oC条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一700C以下，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)，淋巴细胞样品在2c 8 oC条件下保存。7 核酸提取及荧光PCR检测7. 1 注意事项实验室注意事项见附录C。7.2 核酸提取7.2.1 取n个灭菌的1.5 mL Eppendorf管(n为被检样品之和)，编号。7.2.2 每管加人250LDNA提取液(参见附录A)，然后分别加入被检样本各250L，一份样本换用一个吸头，再加入10L蛋白酶K(1mg/mL)，混匀器上
10、振荡混匀，560C消化2h，加入等体积的三氯甲烧，混匀，1500Qg离心15mino 7.2.3 取与7.2.1相同数量灭菌的1.5 mL Eppendorf管，吸取7.2.2各管中的上清液转移至相应的管中，不能吸出中间层，然后再分别加入等体积的一20C预冷的异丙醇，颠倒混匀。7.2.4 15000g离心15min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体;加入800L75%乙醇，颠倒洗涤。7.2.5 15000g离心10min.小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。7.2.6 5000g离心10s，小心倒去上清，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器将其吸干，室温干燥5min10 m
11、in。7.2.7 加入10L灭菌双蒸水，溶解管壁上的DNA，6000g离心5s , 4 c保存备用。若需长期保存须放置-80oC冰箱。7.3 扩增栓测7.3. 1 扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。取出MDVPCR反应液(参见附录A)，在室温下融化后，1000g离心5s，每个PCR反应按表1配制PCR反应混合液(需配制反应液数量=样本个数十阴性对照+阳性对照): 试剂用盐表1MDV PCR反应液21. 75L Taq酶0.25L 将以上PCR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中，充分混匀，然后在每个PCR管中分装22L，转移至样本处理区。7.3.2 加样在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分
12、别加入已提取好的核酸3L，盖上管盖，将PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。3 G/T 27644-2011 7.3.3 PCR扩增检测在扩增检测区进行。7.3.4 反应条件设定第一步:50.C2 min,95 .C 5 min; 第二步:95.C 5 s ,60 .C 45 s，40个循环;60.C时设置采集荧光。7.3.5 荧光素设定Report Dye设定为FAM, Quench Dye设定为BHQ(或Tamra或Eclipse); Reference dye设定为自带校正荧光ROX，如使用其他品牌仪器应设为空白或自带校正。8 条件设定及结果判定8. 1 条件设定禽痛彦病毒2
13、型阳性对照和阴性对照质控标准:阳性对照有S型PCR扩增曲线，而且Ct值35;阴性对照元S型PCR扩增曲线，而且Ct值显示为元。否则此次实验结果元效。8.2 结果判定及描述8.2.1 Ct值35的样本为阳性，表明禽痛彦病毒2型核酸阳性。Ct值显示为元的样本为阴性样本，表明禽殖彦病毒2型核酸阴性。8.2.2 对于35Ct值40的样本建议对样品进行复检。若复检后，Ct值运35，判为禽殖彦病毒2型核酸阳性，否则判为阴性。4 附录A(资料性附录)试剂盒的组成及使用说明A.1 试剂盒组成每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分:GHV 2 PCR反应液Taq酶阴性对照阳性对照双蒸水DNA提取液A.2 说明1
14、. 1 mLX 1管12.5LX1管1. 0 mLX 1管1. 0 mLX 1管1 mLX1管12.5 mLX1管GB/T 27644-2011 A.2.1 GHV 2 PCR反应液。X):含50mmol/L KCl , 10 mmol/L Tris-HCl(pH8. 3) , 2.5 mmol/L MgC12 ,0. 2 mmol/L dNTP mix，上、下游引物各20nmol/mL，探针10nmol/mL, 1 U Taq酶，5%甘油。A.2.2 DNA提取液主要成分:20mmol/L Tris-HCl(pH7.的，200mmol/L EDTA, l% SDS。A.3 使用时的注意事项A
15、. 3.1 在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。A.3.2 反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。5 GB/T 27644-2011 B. 1 1%肝素铀附录B(规范性附录)试剂的配制称取肝素铀1.0 g，溶于三蒸水中，定容至100mL,O. 22m过滤除菌，40C保存。B.2 磷酸盐缓冲撞(0.01moI/L PBS ,pH7. 2) 先配制A液、B液zA液(0.2mol/L NaHzP04溶液): 称取一水合磷酸二氢铀(NaHzP04 H20) 27.6 g，或二水合磷酸二氢铀(NaHzP04 2HzO) 31. 2 g，溶于蒸铺水中，定容
16、至1000mL。B液(0.2mol/L NazHP04溶液): 称取十二水合磷酸氢二铀(NazHP04 12Hz 0) 71. 6 g，或二水合磷酸氢二铀(NazHP04 2HzO) 35.6 g，溶于蒸馆水中，定容至1000mLo 称取8.5g氧化铀，用适量蒸馆水溶解，量取14mLA液和B液36mL，调节pH值至7.2，用蒸馆水定容至1L。6 GB/T 27644-2011 附录C(规范性附录)禽植摩病毒2型荧光PCR检测方法的实验室规范C.1 实验室设置要求c. 1. 1 实验室分为三个相对独立的工作区域:样本制备区、PCR反应混合物配制区和检测区，并且明确标识。c. 1.2 每一区域须有
17、专用的仪器设备，并且明确标识。c. 1.3 进入各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、PCR反应混合物配制区至检测区。c. 1.4 在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，工作服不能穿离各特定区域。c. 1.5 实验室清洁时应按PCR反应混合物配制区、样本制备区至检测区的顺序进行。c. 1.6 不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。C.2 工作区域仪器设备配置C. 2.1 样本制备区仪器设备配置2 .C8 .C冰箱5一20.C冰箱，一80.C超低温冰箱;冰冻台式离心机(注12000 r/min);混匀器;微量加样器(0.5L10L，5L20L，20L
18、200L，200Ll000L);可移动紫外灯。C. 2. 2 PCR反应混合物配制区仪器设备配置2 .C8 .C冰箱;一20.C冰箱;台式离心机(二三3000 r/min) ;混匀器;微量加样器(0.5L10L，5L20L，20L200L，200Ll 000L);可移动紫外灯。C. 2. 3 检测区仪器设备配置荧光PCR仪;可移动紫外灯;打印机。C.3 各工作区域功能及注意事项C. 3.1 样本制备区C. 3.1.1 标本的保存，核酸提取、贮存及其加入至扩增反应管在样本制备区进行。C. 3. 1. 2 可在本区内设立正压条件以避免邻近区的气溶胶进入本区造成污染。C. 3. 1. 3 用过的加样
19、器吸头应放入专门的消毒(例如含次氯酸铀溶液)容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料(原始样本、提取过程中样本与试剂的混合液等)如出现外溅，应作清洁处理并作出记录。C.3. 1. 4 对实验台适当的紫外照射(254nm波长，与工作台面近距离)可以帮助灭活病毒和消除核酸的污染。工作后通过移动紫外线灯管来确保对实验台面的充分照射。C. 3. 2 PCR反应混合物配制区C. 3. 2.1 试剂的分装和反应混合液的制备在本区进行。FEN-叮叮hNH阁。GB/T 27644-2011 C.3.2.2 在整个本区的实验操作过程中，操作者应戴手套。工作结束后应立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸铀等的化学物质的消毒清洁作用。检测区在本区进行荧光PCR检测。PCR扩增产物不能在本实验室开盖，PCR管应抛弃在远离本实验室的垃圾箱中。实验完成后采用紫外灯对实验室进行充分照射。C. 3. 3 C. 3. 3.1 C.3.3.2 C.3.3.3 侵权必究祷书号:155066 1-44332 定价:16.00元版权专有GB/T 27644-2011 打印H期:2012年4月9RF002A
