1、现代分析仪器分析方法通则激光喇曼光谱分析方法通则JY /T 002-1996 General rules for aser raman spectrum analysis 1997-01-23发布1997-04-01实施前言本标准的编写格式和方法符合GB/Tl.1-1993(标准化工作寻则第1单元标准的起草叮茬述规则第1部分z标准编写的基本规定).GR/T1. 4-881标准化工作导则化学分和1J法标准编写规定的要求B本标准附录A、附录且附录C都是提示的附录。本标准起草单位z国家教育委员会本标准主要起草人s郑思定本标准垂加起草人。盛曹生目次1 范围. . . . . . (35 ) Z 引用标
2、准. . . (35) 3 定义-. U们4 方法原理. . (3们5 试剂和材料.8 仪器、设备-. . (37) 7样品. (38) 8 分析步骤. . (3引9 分析结果的茬述. .u 10 安全注意事项. . (11) 附最A(提示的附录)喇曼散射的经典理论. (42) 附录B(提示的附茸喇曼光谱仪主要组成部分的若干垂量. . 归川附录C(提示的附录)喇曼光谱定量分析. . (4引激光喇曼光谱分析方法通则JY /T 0021996 General rules for laser raman spectrum analysis 1 范围本通贝1)规定了喇量光谱的测走相分析方法，本通则适用
3、于般激光喇曼光谱仪的常规分析。2 引用幅在GB/Tl.1- 1993 怀准他l作导则第1单元标准的起草与表述规则第1部分z町、准缩写的基本规定GB/T1. 22-199.i 标准jtx作导则第2单元z际准内容的确定方法第22部分引用标;I!E的规定GB/Tl.4-88 标准他工作导则化学分析方法标准编写规定3定义本标准采用下列定义。3. I 波长 Wavelength 光波在个振动周期内传播的距离，也就是沿波的传播方向，两个相邻的同相位点(如破峰或波谷间的距离。单位常用nm.3.2波数uWavenumb盯技长的倒数，即每厘米内包吉的波仕数目，单位为C01-0 3.3 喇曼1ft移Raman s
4、hift 在喇曼散射中人射光放数与散射光披数间的差值，单位为cm它是反映分子转振能绒的量。3.4 喇曼强ltRaman intensity 喇曼散射光的强度。3. S 杂散光Stray light /五。斯任克斯线JY/T 002- 1996 制激发态虚能级摇摇主态瑞利线反斯托克斯线共握喇曼散射因1lt散射时分子的跃迁能级团进行定量分析，但由于影响喇曼强度的因素很多，实验中准确测量喇量强度有相当难度，因此喇曼先谱的定量分析只有相时童义。5 试剂和材料5.1 标准物质用于校正仪器用的分析纯四氯化碳。用于测定杂散光情况的纯左旋脱髓酸。5. 2 分析纯乙醋、乙醇、丙嗣等用于清洁待测物质的表面或仪器部
5、件。6仪器、设备6.1 仪器组成激光喇量光谱仪应有光源(激光器)、样品室、单色器、检测器和控制及数据处理系统五部分陶成，图2是擞光唰曼光谱仪的组成框图B由于各组成部分的配置上有所改变，现代激光喇曼光谱仪己发展成旱列产品。由于直在色器中的分光兀件光栅配置不同，形成了由单、鼠、三联光栅单色器组成的低到高分辩率和低杂散Jt的喇曼先谱仪，由于来用脉坤激光器和快速记录最统而构成的瞬恋喇曼光谱仪，它可测量时间分群喇曼谱。由于样晶重装有量微草统，树成显微喇曼谱仪。用光电倍增管或用列阵探测器(CCD或口MA)作为检测器呵组成单道或多道激光喇量谱仪。仪器的各个组成部分的其他情况可参阅附录Bo6.2 仪器性能撒光
6、喇曼光谱仪的主要技术指标列于在1，另扑，光电倍增管的暗基数和单色器的透过率且是重要的性能.37 ? 7. 1 在1技术指标名称)恒谱范罔分辨率(在示57g.1nm)包散事在14.5nm处)杂散光(在距瑞利线2Ocm-处)波数精度波数重复率焦距相对光径光栅尺寸(mm)光栅密度Cgrooves/mm)L 回2样品试样JY/T 002-1996 激光喇曼谱仪的主要技术指标Spex 1403 JY U -1000 f211二7士;m 出2cm-1!mmt土二圭二二-0.2cm-1 l 优于0.1m】l0.35m 1m f!7.8 f/8 1l0X 1l0 110XIIO 1800、2400、3600四
7、川、3003600C300的倍敬值)光子计委安器4王言:王直谓:放犬器一一一一典型的激光喇曼光谱仪的组成框图由于喇量测量可实行无损伤直接测量，所以有些送往实验室供检验的样品可以不必制样，直接用作试样进行测量。7.2 试样的制备7.2. I 气体试样将待测气体克入气体池中，试样的气压随样品不同而走回掖体试样7. 2. 2 可以将掖体样品装入内径为lmm的毛细营中或液体样品池内，但对易挥发或有腐蚀性闹悻品，应将其注入毛细晋密封后再进行测量。易光解的样品应装入旋转装置的样品池中利用旋转样品架击测量。深色液体或透明度很低的样品，宜稀释后再进行测量.38 JY /T 002-1996 7.2.3 固体试
8、样粉革悻品可装入毛细营中作90散射的测量，也可将粉末压成片状再作90散射或1800散射的测量。块状样品可将样品的个面制成光滑平面，然后作90或180Q散射的测量，也可装在特别的王维调节样品架上，进行无损伤测量，7.2.4 晶体试样将自主晶体按极化率椭璋的轴加工成六面悻(边长5mm-lOmm为宜).然后按不同几何配置进行测量B8 分析步骤8. I 试样准备首先应了解样品的理化特性和测试要求，以便选择适合的制样方法和在验步骤。根据测试要求按第7项的方法进行试样的制备，8. , 检测前准备启动所有仪器、设备。必要时用阴氧化破肘仪器进行校准，同时检查前光路(从激光器输出端到激光照射到样品上的位置和后光
9、路(主要指单色器的光路的准直情况。8.3 王作条件的选择应根据测定要求和样品情况选择适当的样品架。根据测定要求，喇量信号强弱和光fIJ倍增营的量程去选择缝宽相激光功率.8.3.1 样品架的选择应根据测量要求选择适当的悻品架，液体或粉末样品可选择90散射的毛细管样品架，柑末压片或块状固体可用90。散射样品架;固体、晶体或薄膜可用背散射样品架p易光解样品附选用旋转样品架;晶体棒品应选用口I作三维调节的晶体样品架;需作高温或低温测量的样品应选用高温或低温装置。8.3.2 挟缝宽度的选择时于般样品狭缝应选200m600m.M生物大分子样品狭缝宜选用400m，._SOO/Lm。如需测量高分辨率的喇曼光谱
10、，挟缝宽度应选择得小一点，可选为几个pm到几十个m.固体或单晶样品需测低波数喇量谱时，缝宽宜选得小点8.3.3 激光功率的选择激光器的输出功率要随不同测试样品而改变，对固体或液体的样品且不易光解的直选2C阳lW-500mW;生物样晶应选得低一点，音些样品为了防止热变性取几十毫瓦的激光器输出功率已足够了。些喇量信号弱丑不会光解或拙解样品，可将功率用得大点.运用10mW以上的高功率时激光器易于者化，应综合考虑各种因素。8.3.4 职分时间的选择相分时间般取1l6.5 50 1. 7(绿514.5(绿)528.7C黄撮Kc离f476.2 482.5 520.8 530.9 568. Z 647.1(
11、红676.4 752.5 799.3 He-Ne 632. g(红染料罗丹明B590. O690.。罗丹明白G560. O66).。罗丹明110530. O620.。尼罗蓝高氯酸盐710. O800.。a. Spectro-Phys;cs型号164-08的功率值。b. Spetro -Physics型号16401的功率值o. Spectro-P巧b.ysics型号12SA的功率值(cm ) (mW) 21838.自30021468.4 130 21155.1 250 20986.4 50 21491.8 13 20141.0 60 19932.2 300 19136.3 18914.3 209
12、99 6门20725.4 45 19201. 2 90 18835.9 200 17599. .t 200 15433.6 5C 147且4.2120 13289.0 100 12510.9 30 15802.8 50 43 JY!T 002-1996 表B1-2 .离子iII光器曲主要等离子线空气中的故氏相对强度空气中的波长相对强度(nm) 口m)487. 9日605000 569.1650 27 48日.9033200 572. 4325 23 490.4753 130 573. 95207 16 493.3206 970 577- 2326 69 494.2915 14 578.6560
13、 16 495.5111 10 581.2746 49 496.5073 960 584.3781 10 497.2157 330 587咽。44312 500.9334 1500 588.26250 11 501.7160 620 5吕串.8585118 506.2036 1400 59 1. 20861 38 509.0496 10 592.88124 10 514.1790 360 595.0905 11 514.5319 1000 598.5920 23 516.2745 8 598.9339 20 516.5774 38 603.21291 57 517.6233 41 604.32
14、254 37 521.6日1620 面04.446814 528.6895 150 604.6894 14 530.5690 12 604.9072 14 539.7522 18 605.93735 15 540.2604 11 607.7431 11 540. 7340 12 610.3546 91 545.4307 19 611.4929 气中的搜长(nm) 638.299 610.108 610.975 644.4 7:! 650. 6S 659.895 667.015 667.82自671.704 692. 917 82 显微喇量附件82.1 结构和原理JY/T 002-1996 表B
15、-4 缸，虫激光嚣的主要等离子线相对强度它气巾的波长(nm) :1:l 706.519 1 (1 0 717.394 31 724.317 30 728. 135 co 7.1自88741 753. ., 77 75.1. .105 91 777.730 36 794. 18 19 R1:l.641 相对强度31 4 b 11 O. S 0.4 0.3 C. 0.1 ().2 h了观察检测微粒样品或微区的喇量散射，有些喇曼谱仪均带有显做喇晕附件。将待测试梓置于X-y平白上。对于透明试样用透射照明系统观事透射埠。对于不透明试样用反射照明系统，观察反射憬。透射像或反射惶可直接用日镜观事，也可用投靠
16、屏(lJ-I00型仪器使用)或电视摄悔系统观事B将待检部分走在视场中心，入射光经分束器向下反射，井经物镜罪焦到该址，来自试样的背散射光由物镜收集并通过分束器射到目镜投影观察屏或电视摄惶机供观察，或用直角棱镜和桐告光学装置将散射光聚焦到单色器入射缝，经光栅分光后用PMT或多道检测器测定喇曼光谱。82.2 分柬器一般显微镜中装备的分柬器时非偏振入射光的反射/透射比为50/50，这种分束器很适f显微光谱测定中的大多数试样。但是在大事数情况下来府反射/透射比为10/90或20/80的廿柬器来取代标准分束器是可行的。因为在这种情况下虽然照射激光使用了原有强度的10%或20% .但背向弱喇曼散射光却有90
17、%或80%/以上得以通过分束器粟焦到单色器入射狭缝上，使检测灵敏度大大提高。此夕千使用反/透比小的分束器对于时光不稳定的光敏性样品，如大多散生物样品，也是有利的，因为它降低了照射光强度。82.3 物镜要根据待测试样的类型来选择物镜。对于由亚微米级颗粒组成的试样，宜选择高放大倍率、大数字孔径(NA)的物镜，因为大数字孔径的物镜可以收集更大立体角内的喇量散射光J对F这类样品，通常选用放大倍率为lOOX.NA为0.9或150X.AN为0.95的物镜。时于尺度大于5m的样品，则50X或60X和o.gNA的物镜已足使用。对于埋于寄主物内的样品，则要选用工作距离物镜。通常一套可满足大部分应用要求的物镜陈包
18、括用于较小样品5m)的物镜60X或50:、Q.8NA物镜，用于埋在寄主中的样品的50X、Q.55NA和趋桂工作距离臼mm)物镜，适于璇璃46 JY IT 002-1996 毛细管扁的llIt圆的)内液体样品的20X、0、45NA物镜，以及用于初步观察和定位测在区的10 X、Q.3NA或5X、Q.INAo自些物镜镀有抗反射层，它会在某些波段的激光照射下产生卡扰线。例如Nikon-tO、lOOX物镜.Olympus80 X、100X物镜在A，+的激光514.5nm线照射下去产生850cm91cm-1, 925cm-1 、1260cm1和1300cm-j的峰。而用488nm和K，+激光的647.10
19、m，线撤走时，这些峰均不出现。因此，在显橄喇曼测定中，切记这种效应，否则会导致错误结果，通常;在用改变激发披长方法来避开这种影响，也叮用一空间媳克片(种能使激光焦点体积外面的各忡咒辐射被中间光栏排除的滤光装置)来抑制这种干扰。82.4 现察系统最简单的观事系统是显微镜物镜。当激光照射到高反射率样品时，就会产生极强的反射光相瑞利散射，这种情况很睿属损伤天目辜者的眼睛，故现今一般已不采用。l)-10型喇曼做探部叶，果用投影f弄来观察，当样品是弱反射体时，样品变得较暗，对比度是，难f区分样品的形貌持征，给工作带来不便。如果用电视摄像统进行观粟，明显地比投影屏方便，样晶明亮得窑，对比度也高些，很容易识
20、别样品形貌特征细节。但旧的电视摄像最统是分辨率不高的光导摄憧管相机，为f避免摄像管被强激光损坏，摄像管前端放置了个中密度滤光片。现在用口口相机组成的观事祟统耳、仅免除了这阳虑，而且分辨率大为提高，是较理想的现草草统句82.5 桐吉系统搞合光路由消色差又Z透镜组成.其焦距要按能使整个光栅充分照明的要求去设计。此消色差扭透镜能使喇曼光谱红、蓝两端吐的色差彼此抵消，即反射光(瑞利线)和离它最远的喇曼散射部能同佯罪焦在单色器入射狭缝上。82.6 照明系统最通用的光学显微镜照明统是透射相反射明场照明系统。当考查透明样品.如聚合物暖、生物细胞物质和组织切片等透明样晶时，要使用透射明场反射明场用来考查团体表
21、面这两仲照明系统也是显橄喇曼谱仪上最常用的。此外，光学显微镜中使用的偏振光(反、哥们捆莹透射)和F带衬度(反、透肘)照明也都可装配到显攒喇曼谱仪上来，观事不能用明场照明在统考查的特征。B2.7 喇曼图幢技术昂微喇曼光度计的个极其重要的特*是可薪得样品分f在样品幕体中分布收况的喇曼图像。第一种成惶技术是基于作为检测器的光电电视摄像机的事通道优越性回首先，将样品置?显嗷镜载物片上，用激光照射显辙镜的整个视场。旋转激Jt束以形成一个指向暗场显徽镜物镜聚光镜的环开光圈。罪焦后的激光束在样品表面顺序照射，积分成具有走面烈的照射明场户产尘的喇量散射经单色器分光后，选择一特征谱线照到摄障机上所成之像，即jJ
22、该持征谱钱所代在的分子在照射明场内的分布图像，此神革统的空间分辩率为1m.XJ-f良好喇曼散射体悻l毡，可形成清断的喇曼图像，而又T莹的喇曼散射体样品则唯子形成可分酶的喇曼罔常分醉不开喇曼特征峰与荧光背景。来用CCD摄像机井结合阿德玛变换图障技术，可以获得分棉大布改善的喇曼图像。这种成悻技术的主要饨点在于检测器同时观事到了整个视野，一注在得慌l王样品分布罔悔。第二种成像技术是使用计算机控制的步进马达去驱动X-y平台悟坐标平面顺序扫描，然后用计算机将在扫描的每一点上某种特征谱线强度肘照坐标位置草原成该特征谱线茬征47 JV /T 002-1996 的样品分子在扫描区域内的分布图悻.这是样品相对于
23、静止激光束移动的扫描方式，其优点是可以在得莹的喇晕散射体样品的宏观图像。缺点是速度慢，且不适于较为肇重的样品或置于恒温袖、变温池和压力池中的样品。第三种技术是使聚焦激光在静止的样品上扫描，井顺序记录样品不同位置处的喇曼光谱。此法的优点是可用于各种肇重样品和置予恒温、变温、压力地中的样品。亦可得到它们的宏现酣曼图悻。负起点是实现激光束扫描的光学系统较使样品由扫描的装置复杂。48 JY/T 002-996 附录C(提示的附录)喇曼光谱定量分析喇曼光谱的定量分析是以下式为基础2也=loSNHL 4:rrsn2 式中也收集到的喇曼散射光通量(正比于喇曼强度)。激发光的光通量S. 喇曼散射星数H 样品有
24、效长EN 单位体积内的分于数I 考虑到折射率和样品向场效应等因素影响的系数一一散射光对噩焦透镜的半张角由上式可知唰曼强度与样品的浓度成正比，但直接比较不同浓度样品间的喇量强度去进行定量分析是困难的，有效的方法是利用加入内标，即在被测样品中加入少量已知浓度的物质，均匀熄告后，选合适的方法制样.选内标物质的一矗喇曼线作基准，将样品的喇曼线强度与内标线进行比较比较喇曼峰的高度或积分面帜).以此为基础即可对不同浓度的样品作出定量分析。选择内标必须满足的条件是化学性质稳定，且不与样晶发生化学反应。内标的啊曼谱线和被分析的喇曼谱线互不干扰。内标物质纯度高，不吉被测物质成卦。喇量光谱定量分析的灵敏度低，准确度也差，所以一般不景用。49
