1、Mai 2015DEUTSCHE NORM DIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL)Preisgruppe 7DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.100.10!%Ay1“230
2、8614www.din.deDDIN 10054Milch und Milcherzeugnisse Bestimmung des L- und D-Milchsuregehalts (L- und D-Lactat) Reflektometrisches Verfahren (Screening-Verfahren)Milk and milk products Determination of L- and D-Lactic acid content (L- and D-Lactate) Reflectometric method (screening method)Lait et prod
3、uits laitiers Dtermination de la teneur en L- et D-acide lactique (L- et D-lactate) Mthode reflectometrique (Examen analytique)Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 9 SeitenDIN 10054:2015-05 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Normative
4、 Verweisungen 4 3 Kurzbeschreibung .4 4 Reagenzien .4 4.1 L-Milchsure Monolithiumsalz .4 4.2 D-Milchsure Monolithiumsalz .4 4.3 Analysestbchen .4 5 Gerte 5 5.1 Analysenwaage, .5 5.2 Reflektometer, 5 5.3 Erlenmeyerkolben 5 5.4 Messkolben, .5 5.5 Magnetrhrgert 5 5.6 Gert zum Zerkleinern von Kse, .5 5.
5、7 Gert zum Homogenisieren der Probenlsung von Kse, 5 6 Probenahme .5 7 Durchfhrung .5 7.1 Allgemeines 5 7.2 Vorbereitung der Proben 5 7.2.1 Milch 5 7.2.2 Saure Milcherzeugnisse 6 7.2.3 Milchpulver und andere Trockenmilcherzeugnisse .6 7.2.4 Kse und Kseerzeugnisse 6 7.3 Herstellung der Probenverdnnun
6、g 6 7.4 Kalibration 7 7.5 Bestimmung .7 8 Auswertung 7 8.1 Berechnung 7 8.2 Zuverlssigkeit der Methode 8 9 Untersuchungsbericht 8 Literaturhinweise 9 DIN 10054:2015-05 3 Vorwort Diese Norm wurde vom Arbeitsausschuss NA 057-05-13 AA Milch und Milcherzeugnisse Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ i
7、m DIN-Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL), erarbeitet. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Elemente dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. Das DIN ist nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu identifizieren. DIN
8、10054:2015-05 4 L-LDH 1 Anwendungsbereich Dieses Dokument legt ein enzymatisch/reflektometrisches Screening-Verfahren (Teststreifennachweis) zur Bestimmung des Gehaltes an L- und D-Milchsure (L- und D-Lactat) in Milch und Milchprodukten fest. Der nach diesem Verfahren bestimmte L- und D-Milchsuregeh
9、alt sowie L- und D-Lactatgehalt, wird als L- und D-Milchsure berechnet. 2 Normative Verweisungen Die folgenden Dokumente, die in diesem Dokument teilweise oder als Ganzes zitiert werden, sind fr die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene A
10、usgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN EN ISO 707, Milch und Milcherzeugnisse Leitfaden zur Probenahme 3 Kurzbeschreibung Milchsure (L- und D-Form) wird durch Nicotinamidadenin-dinucleotid (NAD) in Gegenwart
11、 der Enzyme L-Lactat-Dehydrogenase (L-LDH) und D-Lactat-Dehydrogenase (D-LDH) zu Brenztraubensure (Pyruvat) oxidiert. Die in diesen Reaktionen gebildete reduzierte Form des Nicotinamid-adenin-dinucleotids (NADH) reduziert in Gegenwart von Diaphorase ein Tetrazoliumsalz (TZS) zu einem Formazan. Die M
12、enge des gebildeten Formazans ist der vorhandenen L-Milchsure bzw. D-Milchsure proportional. Die Menge des gebildeten Formazans wird reflektometrisch bestimmt. Das Gleichgewicht der Reaktionen (1) und (2), das weitgehend auf der Seite von Milchsure liegt, wird durch die Reaktion der reduzierten Form
13、 des Nicotinamid-adenin-dinucleotids (NADH) mit dem Tetrazoliumsalz (TZS) auf die Seite von Brenztraubensure (Pyruvat) und NADH verschoben. Die Reaktionen laufen nach folgendem Reaktionsschema ab: + + HNADHPyruvatNADLactatLLDHL+ + HNADHPyruvatNADLactatDLDHD+ + NADFormazanTZSHNADHDiaphoraseDie Enzyme
14、 L-Lactat-Dehydrogenase und D-Lactat-Dehydrogenase sind stereospezifisch, so dass die beiden isomeren Milchsuren nebeneinander bestimmt werden knnen. 4 Reagenzien Es sind analysenreine Chemikalien zu verwenden. Das verwendete Wasser muss destilliert oder mindestens von entsprechender Reinheit sein.
15、4.1 L-Milchsure Monolithiumsalz 4.2 D-Milchsure Monolithiumsalz 4.3 Analysestbchen Die Analysestbchen bestehen aus einer lnglichen Trgerschicht aus Kunststoff, auf die in geeigneter Weise (z. B. durch Kleben) zwei saugfhige, kapillaraktive Zonen (z. B. Papier) aufgebracht sind. Eine Zone enthlt DIN
16、10054:2015-05 5 die Chemikalien/Reagenzien zur L-Lactatbestimmung und die andere Zone die Chemikalien/Reagenzien zur D-Lactatbestimmung. ANMERKUNG Gebrauchsfertige Analysestbchen zur Bestimmung des Gehaltes an L- und D-Milchsure (L- und D-Lactat) in Milch und Milchprodukten sind im Handel erhltlich1
17、). 5 Gerte 5.1 Analysenwaage, Skalenteilung 0,1 mg. 5.2 Reflektometer, zur Messung der diffusen Reflexion im Absorptionsbereich des gebildeten Formazans, ausgestattet mit einem Adapter zur Auswertung von Analysestbchen. 5.3 Erlenmeyerkolben oder Becherglas, Nennvolumen 200 ml. 5.4 Messkolben, Nennvo
18、lumen 100 ml. 5.5 Magnetrhrgert oder anderer geeigneter Rhrer. 5.6 Gert zum Zerkleinern von Kse, z. B. Haushaltsmixer. 5.7 Gert zum Homogenisieren der Probenlsung von Kse, z. B. Ultra Turrax2) 6 Probenahme Die Probenahme ist kein Bestandteil des in diesem Dokument festgelegten Verfahrens. Ein geeign
19、etes Probenahmeverfahren ist in DIN EN ISO 707 angegeben. 7 Durchfhrung 7.1 Allgemeines Whrend der Durchfhrung der Untersuchung muss jegliche Verunreinigung der Probe sowie der Analysestbchen insbesondere durch Speichel und Schwei vermieden werden. Pipettenspitzen drfen nicht mit den Hnden berhrt we
20、rden, da die Hautoberflche Milchsure enthlt. 7.2 Vorbereitung der Proben 7.2.1 Milch Khl gelagerte Proben werden auf Raumtemperatur (20 2) C gebracht. Die Milchprobe wird sorgfltig durchmischt. 1) Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieses Dokuments und bedeutet keine Anerkennung d
21、urch DIN. 2) Ultra Turraxist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieses Dokuments und bedeutet keine Anerkennung dieses genannten Produktes durch DIN. DIN 10054:2015-05 6 7.2.2 Saure Milcherzeugnisse Khl gelagerte Proben werden
22、 auf Raumtemperatur (20 2) C gebracht. Die Packung wird unmittelbar vor dem Wgen geffnet und die Probe sorgfltig durchmischt. Anschlieend wird die Bestimmung unverzglich durchgefhrt. 7.2.3 Milchpulver und andere Trockenmilcherzeugnisse Das Pulver wird auf Raumtemperatur (20 2) C gebracht. Nach dem f
23、fnen der Packung wird der gesamte Inhalt mglichst schnell mit einem Glasstab oder einem geeigneten Mischgert gemischt. Anschlieend wird die Einwaage fr die Bestimmung unverzglich durchgefhrt. 7.2.4 Kse und Kseerzeugnisse Vor der Analyse wird die Rinde, die schmierige Auenseite oder die Schimmel-Ober
24、flchenschicht des Kses so entfernt, dass man eine Untersuchungsprobe erhlt, die den blichen Verzehrzustand des Kses reprsentiert. Die Untersuchungsprobe wird mittels eines geeigneten Mahl- oder Reibegerts (5.6) zerkleinert. Hartkse und halbfeste Kse werden vorab vorzugsweise in Wrfel von etwa 15 mm
25、Kantenlnge geschnitten. Die Wrfel werden durch Schtteln in einem Gef gemischt. Die Untersuchungsprobe wird dann wie oben angegeben zerkleinert. Die zerkleinerte Probe wird schnell durchmischt und, wenn es bei halbfesten und Hartksen erforderlich ist, ein zweites Mal zerkleinert und erneut grndlich d
26、urchmischt. Kseproben, die nicht gemahlen oder gerieben werden knnen, werden durch intensives Kneten grndlich durchmischt. Dabei ist ein Feuchtigkeitsverlust zu vermeiden. Die Untersuchungsprobe wird bis zum Beginn der Untersuchung in einem luftdichten Gef gelagert. Whrend der gesamten Probenvorbere
27、itung ist ein Feuchtigkeitsverlust zu vermeiden. 7.3 Herstellung der Probenverdnnung Die Probemenge bzw. Verdnnung wird so gewhlt, dass die Milchsurekonzentration in der Probelsung zwischen 5 mg/l und 60 mg/l liegt. Milch kann unverdnnt eingesetzt werden. Die in Tabelle 1 angegebenen Einwaagen werde
28、n beispielhaft empfohlen. Tabelle 1 Empfohlene Einwaagen L-Milchsure (g) D-Milchsure (g) Milchpulver 15 15 Joghurt und Sauermilchprodukte 0,1 0,2 Molkepulver 0,5 15 Kseproben Hartkse 0,2 0,2 Schmelzkse 1,0 2,0 Die entsprechenden Mengen der nach 7.2 vorbereiteten Proben werden auf 0,1 mg eingewogen.
29、Flssige Proben werden in einem 100-ml-Messkolben eingewogen und es wird mit Wasser zur Marke aufgefllt. DIN 10054:2015-05 7 Feste, leicht lsliche Proben werden in einem 200-ml-Erlenmeyerkolben oder Becherglas mit etwa 60 ml heiem Wasser (etwa 55 C) versetzt und gut durchgemischt. Kseproben nach 7.2.
30、4 werden mit etwa 30 ml heiem Wasser (etwa 55 C) versetzt. Die Probenlsung wird mit dem Homogenisiergert (5.7) etwa 1 min bzw. bis zur homogenen Verteilung der Probe gemixt. Am Homogenisiergert (5.7) anhaftende Probenreste werden mit etwa 20 ml Wasser vollstndig in den Erlenmeyerkolben (5.3) bergefh
31、rt. Der Erlenmeyerkolben wird verschlossen und 15 min geschttelt oder auf dem Magnetrhrer (5.5) gerhrt. Die Mischung wird in einen 100-ml-Messkolben quantitativ bergesplt. Anschlieend wird der Messkolben mit Wasser zur Marke aufgefllt. 7.4 Kalibration Bei Verwendung von Messgerten ohne interne Kalib
32、ration werden mindestens sechs Kalibrierproben bentigt, deren L-Milchsure- und D-Milchsuregehalt im Bereich von 1 mg/l bis 60 mg/l liegt. Zur Herstellung einer Stammlsung mit einem Gehalt von 1,000 g/l L-Milchsure und einem Gehalt von 1,000 g/l D-Milchsure werden 1,065 8 g L-Milchsure-Monolithiumsal
33、z und 1,065 8 g D-Milchsure-Monolithiumsalz mit Wasser in einem 1000-ml-Messkolben gelst. Zur Herstellung der Kalibrierproben wird die Stammlsung mit Wasser auf die gewnschte Konzentration verdnnt. Danach wird die relative diffuse Remission, wie in 7.5 beschrieben, bestimmt. 7.5 Bestimmung Das Analy
34、sestbchen wird zur vollstndigen Benetzung etwa 2 s in die nach 7.2 vorbereitete Probe eingetaucht. berschssige Flssigkeit wird vom Stbchen auf einem saugfhigen Tuch vorsichtig seitlich ablaufen gelassen. Nach 5 min wird die relative diffuse Remission fr jede der beiden Zonen gemessen. 8 Auswertung D
35、ie nach 7.5 zonenseparat bestimmten Remissionswerte der Kalibrierproben bekannter L- bzw. D-Milchsure-Konzentration (7.4) werden zur Berechnung einer linearen Regressionsgleichung eingesetzt, wobei jeweils der dekadische Logarithmus (x-Log-Transformation) der ermittelten L- bzw. D-Milchsure-Massenko
36、nzentration (mg L- bzw. D-Milchsure/l Probelsung) die unabhngige Variable (x-Achse) und der entsprechende Remissionswert die abhngige Variable (y-Achse) darstellt. ANMERKUNG Bei Gerten mit interner Kalibration ist die Auswertung integriert. 8.1 Berechnung Der Massenanteil w an L- bzw. D-Milchsure (L
37、- bzw. D-Lactat) in mg je 100 g der Probe wird nach folgender Gleichung (1) berechnet: mVw100=(1) Dabei ist w der Gehalt an D- bzw. L-Milchsure in Milligramm je 100 Gramm Probe; die Massenkonzentration an L- bzw. D-Milchsure in Milligramm je Liter Probelsung, siehe 8; V das Volumen der Probelsung (7
38、.3), in Milliliter; m die Einwaage der Probe, in Milligramm; 100 der Umrechnungsfaktor von Gramm in 100 Gramm. Das Ergebnis wird ohne Nachkommastellen angegeben. DIN 10054:2015-05 8 8.2 Zuverlssigkeit der Methode Die in Tabelle 1 dargestellten Przisionsdaten wurden in einem durch die Arbeitsgruppe C
39、hemische und physikalische Untersuchungsverfahren der Milch“ des Bundesamtes fr Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) zur Durchfhrung des 64 des Deutschen Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuchs (LFGB) durchgefhrten Ringversuch ermittelt. Tabelle 2 Statistische Daten des Ringversuches
40、 Statistische Kenngre Molkepulver Gouda Hartkse Joghurtpulver D-Lactat L-Lactat D-Lactat L-Lactat D-Lactat L-Lactat D-Lactat L-Lactat Anzahl der teilnehmenden Laboratorien 12 12 13 13 13 13 12 12 Anzahl der Ausreier 1 1 1 1 1 1 1 1 Mittelwert (mg/100 g) 33 1166 928 1056 726 760 1199 3355 Wiederholst
41、andardabweichung sr(mg/100 g) 4 102 44 77 72 43 65 148 Relative Wiederholstandardabweichung sr,rel(%) 12 9 5 7 10 6 5 4 Wiederholgrenze r mg/100g 11 280 120 210 200 120 180 410 Relative Wiederholgrenze rrel(%) 33 25 13 20 28 16 15 12 Vergleichstandardabweichung sR(mg/100 g) 5 124 134 106 108 70 145
42、300 Relative Vergleichstandardabweichung sR,rel(%) 15 11 15 10 15 9 12 9 Vergleichgrenze R mg/100 g 14 340 370 290 300 190 400 840 Relative Vergleichgrenze Rrel(%) 43 30 40 28 42 25 34 25 9 Untersuchungsbericht Im Untersuchungsbericht sind mindestens anzugeben: a) angewendetes Untersuchungsverfahren
43、 unter Verweisung auf diese Norm; b) Art der Probe; c) Art und Datum der Probenahme; d) L- bzw. D-Milchsuregehalt, angegeben als Massenanteil in Milligramm je 100 Gramm Probe (mg/100 g); e) Untersuchungsdatum; f) Begrndung, falls von dieser Norm abgewichen worden ist. DIN 10054:2015-05 9 Literaturhinweise 1 Oswald Sonntag; Trockenchemie, Analytik mit trgergebundenen Reagenzien; Wissenschaftliche Verlagsges., 1988.
