1、第34讲 基因工程,知识1 基因工程的工具与操作步骤,知识2 基因工程的应有,知识梳理,考点一 基因工程的工具及基因工程操作中的几个重要环节,考点二 基因工程的应用,考点突破,知识1 基因工程的工具与操作步骤 一、基因工程的含义与工具,教材研读,1.基因工程与遗传工程:基因工程是狭义的遗传工程。广义的遗传工程 泛指把一种生物的 遗传物质 (细胞核、染色体、脱氧核糖核酸 等)移到另一种生物的 细胞 中去,并使这种遗传物质所带的遗传 信息在受体细胞中 表达 。,2.基因工程的核心是 构建重组DNA分子 。,3.基因工程的工具 (1)限制性核酸内切酶 a.来源:主要是从 微生物 (如细菌)中分离纯化
2、出来的。 b.功能:识别并切开每条链中两个相邻脱氧核苷酸之间的 磷酸二酯 键 。 c.特点:具有专一性。 表现在以下两个方面:识别DNA分子中某种特定的 核苷酸序列 ; 使每一条链中特定位点的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,(2)DNA连接酶 功能:将具有 末端碱基互补 的2个DNA片段连接起来。 (3)载体 a.最常用的载体 质粒 。 实质:是能够 自主复制 的双链环状DNA分子,是一种特殊的遗传 物质,在细菌中以独立于 拟核 之外的方式存在。 b.其他载体: 噬菌体 、植物病毒和动物病毒等。,二、基因工程的操作步骤 1.获得目的基因 (1)目的基因:人们所需要的基因。如:人的胰岛素基
3、因、植物的抗病基 因等。 (2)获取方法,2.形成重组DNA分子 通常用 相同的 限制性核酸内切酶分别切割含有目的基因的供体 DNA分子和载体(如质粒),使其产生 相同的 粘性末端,然后用 DNA连接酶将两者连接在一起,形成重组DNA分子。,3.将重组DNA分子导入受体细胞 常用的受体细胞:大肠杆菌、枯草杆菌、 酵母菌 和动植物细胞 等。,4.筛选含有目的基因的受体细胞 (1)筛选原因:并不是所有的细胞都接纳了重组DNA分子。 (2)筛选方法举例:质粒上有抗生素如四环素的 抗性 基因,所以含 有这种重组质粒的受体细胞就能够在有四环素的培养基上生长,而没有 接纳重组质粒的细胞不能在这种培养基上生
4、长,这样就能筛选出含有重 组DNA分子的受体细胞。,5.目的基因的表达 目的基因在 宿主细胞 中表达,产生人们需要的功能物质。,知识2 基因工程的应用,1.基因工程与遗传育种 (1)转基因植物 培育优点 (2)转基因动物 a.含义:转入了 外源基因 的动物。 b.培育优点:省时、省力。,2.基因工程与疾病治疗 (1)基因工程药物,(2)基因治疗指的是向目标细胞中引入 正常功能 的基因,以 纠正或补偿 基因的缺陷,达到治疗的目的。,3.基因工程与生态环境保护 (1)利用转基因植物生产聚羟基烷酯,用于合成可降解的新型塑料。 (2)改造分解石油的细菌,提高其分解石油的能力。 (3)利用转基因微生物吸
5、收环境中的重金属,降解有毒化合物和处理工 业废水。,1.下列有关限制性核酸内切酶的叙述,不正确的是 ( D ) A.从反应类型来看,限制性核酸内切酶催化的是一种水解反应 B.限制性核酸内切酶的活性受温度、pH的影响 C.一种限制性核酸内切酶只能识别双链DNA中某种特定的脱氧核苷酸 序列 D.限制性核酸内切酶识别的序列越短,则该序列在DNA中出现的概率 就越小,解析 限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷 酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断 裂,即催化的是一种水解反应,故A正确;限制性核酸内切酶的活性受温 度、pH的影响,在最适宜的温度和pH条件下,酶的
6、活性最高;温度和pH 偏高或偏低,酶的活性都会降低;在过酸、过碱或温度过高条件下酶会 变性失活,而在低温条件下酶的活性降低,但不会失活,故B正确;一种限 制性核酸内切酶只能识别双链DNA中某种特定的脱氧核苷酸序列,并 在特定的位点切割磷酸二酯键,说明酶具有专一性,故C正确;限制性核酸 内切酶识别的序列越短,则该序列在DNA中出现的概率就越大,故D错误。,2.下列有关基因工程叙述错误的是 ( D ) A.最常用的载体是大肠杆菌的质粒 B.工具酶主要有限制性核酸内切酶和DNA连接酶 C.该技术人为地增加了生物变异的范围,实现种间遗传物质的交换 D.基本原理是DNA具有双螺旋结构以及遗传信息传递和表
7、达方式相同,解析 基因工程的载体包括质粒和动植物病毒等,但是最常用的是 大肠杆菌的质粒,A正确。基因工程的工具酶主要有限制性核酸内切酶 和DNA连接酶,因为基因工程的核心是构建重组DNA分子,所以必须要 用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶,B正确。基因工程可以打破远缘 亲本杂交不亲和的障碍,实现了物种间的育种,C正确。基因工程的基本 原理是让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地 表达,D错误。,3.嗜热土壤芽孢杆菌产生的-葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶, 为使其在工业生产中更好地应用,现利用大肠杆菌表达BglB酶开展了 以下试验: (1)PCR扩增BglB基因时,选
8、用 基因组DNA作模板。 (2)如图为质粒限制性核酸内切酶酶切图谱。BglB基因不含图中限制性 核酸内切酶识别序列。为使PCR扩增的BglB基因重组进该质粒,扩增的 BglB基因两端需分别引入 和 不同限制性核酸内切酶 的识别序列。,注:图中限制性核酸内切酶的识别序列及切割形成的粘性末端均不相同 (3)大肠杆菌不能降解纤维素,但转入上述构建好的表达载体后则获得 了降解纤维素的能力,这是因为 。,(4)下列有关限制性核酸内切酶的叙述中正确的是 ( ) A.用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部,获得一个目的基因时, 被水解的磷酸二酯键有2个 B.限制性核酸内切酶识别的序列越短,则该序列在DNA
9、中出现的概率 就越大 C.CATG和GGATCC序列被限制性核酸内切酶切出的粘性 末端碱基数不同 D.只有用相同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的片段和质粒,才能 形成重组质粒,答案 (1)嗜热土壤芽孢杆菌 (2)Nde BamH (3)转基因的大肠 杆菌分泌出有活性的BglB酶 (4)B,解析 (1)BglB基因存在于嗜热土壤芽孢杆菌基因组中,故应以该菌的 基因组DNA为模板进行基因扩增。(2)目的基因与质粒进行重组时,需 将目的基因插到启动子和终止子之间,结合示意图可知,应在扩增的 BglB基因两端分别引入Nde和BamH两种限制性核酸内切酶的识别 序列。(3)该基因表达载体中含有BglB
10、基因,其表达产生的-葡萄糖苷酶 可分解纤维素,这样大肠杆菌就获得了分解纤维素的能力。,(4)切割一个DNA分子中部,获得一个目的基因时,被水解的磷酸二酯键有4个;CATG和GGATCC序列被限制性核酸内切酶切出的粘性末端碱基数相同,都为4个;只要切割出来的粘性末端的碱基序列相同,都可以 被DNA连接酶连接。,考点一 基因工程的工具及基因工程操作中的几个重要环节一、基因工程的工具,考点突破,1.限制性核酸内切酶 (1)限制性核酸内切酶(限制酶)的作用 限制酶切割时断开的是DNA分子中的磷酸二酯键(即相邻脱氧核苷酸 间的键),而不是两条链之间的氢键。如图:,(2)限制性核酸内切酶具有专一性,表现在
11、两个方面: 识别双链DNA分子中特定的脱氧核苷酸序列。 切割特定序列中的特定位点。如图:,2.DNA连接酶 DNA连接酶的作用 将两个来源不同的DNA用相同的限制性核酸内切酶切割,形成相同的 粘性末端。DNA连接酶能催化磷酸与脱氧核糖之间化学键的形成,将 两个DNA末端的缝隙“缝合”起来。如图:,3.载体的种类及作用 (1)载体应具备的特征 能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。 有1个或多个限制性核酸内切酶切点,以便与外源基因连接。 具有某些标记基因,如(抗性基因)以便进行筛选。 (2)载体的种类 细菌质粒,最常用大肠杆菌质粒。 噬菌体和某些动植物病毒。,一般来说天然的载体往往不能满足人们的所有
12、要求,因此人们根据不同 目的和需求,对某些天然的载体进行人工改造。 (3)作用 一是用它作为运载工具,将目的基因送到宿主细胞中去;二是利用它在 宿主细胞内对目的基因进行大量复制。,二、基因工程操作中的几个重要环节 1.获得目的基因 (1)序列未知:建立一个包括目的基因在内的基因文库,再从基因文库中 获取。 (2)序列已知:用化学方法合成或者用PCR扩增目的基因。 (3)PCR技术与DNA复制的比较,知能拓展 人工合成目的基因的途径 逆转录法 以从细胞中提取分离出的mRNA为模板,mRNA 单链DNA双链DNA(目的基因)。 根据蛋白质中氨基酸序列合成目的基因 根据蛋白质中氨基酸序列 mRNA中
13、碱基序列 DNA碱 基序列 目的基因。,2.形成重组DNA分子(1)一般采用同种限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因,以获得相同 的粘性末端,以利于形成重组DNA分子,但有时用不同的限制性核酸内,切酶处理也可以获得相同的粘性末端。 (2)目的基因的插入可能会破坏转基因生物原有基因的结构,影响转基 因生物的正常生长,甚至致死。 (3)限制性核酸内切酶只识别双链DNA分子中特定核苷酸序列,对RNA 不起作用。 (4)用DNA连接酶连接时,可形成3种不同的连接物:目的基因载体连 接物、载体载体连接物、目的基因目的基因连接物,导入受体细胞 后,可利用抗性基因的差异进行筛选。,3.将重组DNA分子导入受体
14、细胞,4.筛选含有目的基因的受体细胞 (1)原理:质粒上有抗生素(如四环素)的抗性基因等标记基因。 (2)方法:利用选择培养基筛选。 (3)举例: 所有受体细胞 含四环素培养基 生活的受体细胞重组DNA分子 (质粒上有四环素抗性基因) 含重组DNA分子的受体细胞,在实际应用中还有: a.检测是否插入目的基因,利用DNA分子杂交技术,目的基因DNA一条 链(作探针)与受体细胞中提取的DNA杂交,看是否有杂交带。 b.检测是否转录出了mRNA,利用核酸分子杂交技术,目的基因DNA一 条链(作探针)与受体细胞中提取的mRNA杂交,看是否有杂交带。 (4)目的基因的表达:看到目的性状或分离到目的基因表
15、达产物。 检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法是从转基因生物中提取蛋白 质,用相应的抗体进行抗原抗体杂交。 个体生物学水平的鉴定:如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。,一、对限制酶专一性的分析 限制酶具有专一性,表现在两个方面:,1.识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。识别序列的特点:呈现碱基 互补对称,无论是奇数个碱基还是偶数个碱基,都可以找到一条中心轴 线,如图,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。这 种序列称为回文序列。如:GCCG 以中心线为轴,两侧碱基互补对称; CCAGGGGTCC以AT为轴,两侧碱基互补对称。,2.切割特定序列中的特定位点,使每一条链中特定部位的两个
16、核苷酸之 间的磷酸二酯键断开。知能拓展 (1)限制酶具有专一性,一般情况下,不同限制酶切割形成的 粘性末端不同。但也有用不同限制酶处理后形成的粘性末端相同,可以 用DNA连接酶进行连接。如GGATCC和GATC序列不同,但用限制酶 处理后形成的粘性末端相同。 (2)一般情况下,用同一种限制酶分别处理质粒和目的基因,使其具有相 同的粘性末端。但如果都用相同的两种限制酶分别处理,也可形成分别,对应的相同粘性末端,例如目的基因的两端分别有BamH和Hind的 酶切位点,质粒上也有这两种酶的切点。如图所示:,二、基因工程操作中易错点分析 1.基因文库不是直接保管相应基因,基因文库中的基因保存在受体菌
17、中。 2.原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,有利于目的基因 的复制与表达,因此常采用大肠杆菌等原核生物作为受体细胞。 3.植物细胞的全能性较高,可经植物组织培养过程成为完整植物体,因此 受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞;动物基因工程中的受体细胞一 般是受精卵。,4.操作工具有三种,但工具酶常用两种,载体不是酶;在基因工程操作步 骤“获得目的基因”和“形成重组DNA分子”中通常用同种限制酶, 目的是产生相同的粘性末端;DNA连接酶只在“形成重组DNA分子” 操作中用到。 5.一般情况下,用同一种限制性核酸内切酶切割质粒和含有目的基因的 片段,但有时可用两种限制性核酸内切酶切割质粒和
18、目的基因,这样可 避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。,6.不熟悉标记基因的种类和作用:标记基因的作用筛选、检测目的 基因是否导入受体细胞,常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产 物为带颜色的物质)等。,典例1 在体内,人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽 链,此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原, 进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后,产生A、B两 条肽链,再经酶丙作用生成由51个氨基酸残基组成的胰岛素。目前,利 用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题: (1)人体内合成前胰岛素原的细胞是 ,合成胰高血糖素的 细胞是 。 (2)
19、可根据胰岛素原的氨基酸序列,设计并合成编码胰岛素原的,序列,用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载 体,再经过细菌转化、筛选及鉴定,即可建立能稳定合成 的基 因工程菌。 (3)用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时,培养液无抗原抗体反应, 菌体有抗原抗体反应,则用该工程菌进行工业发酵时,应从 中 分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。解题关键 了解基因工程的基本操作程序,尤其是获取目的基因的方 法这一步,并能在具体问题中灵活运用。,答案 (1)胰岛细胞 胰岛细胞 (2)DNA 胰岛素原 (3)菌体,解析 (1)人体合成前胰岛素原的细胞是胰岛细胞,合成胰高血糖素的 细胞是
20、胰岛细胞。(2)用蛋白质工程生产胰岛素时,需根据胰岛素原的 氨基酸序列,设计并合成编码胰岛素原的脱氧核苷酸序列(目的基因),然 后再构建胰岛素原基因重组表达载体,导入细菌细胞内,再经过细菌转 化、筛选及鉴定,即可建立能稳定合成胰岛素原的工程菌。(3)运用抗 原抗体检测法检测胰岛素原时,培养液无抗原抗体反应,菌体有抗原 抗体反应,故应从菌体中分离、纯化胰岛素原。,1-1 科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组,并在大肠杆 菌中成功表达。如图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌 的过程。请据图回答问题。,(1)步骤和中常用的工具酶是 和 。 (2)图中质粒上有抗氨苄青霉素和抗四环素两个
21、标记基因,经过和 步骤后,有些质粒上的 基因内插入了外源目的基因, 形成重组质粒,由于目的基因的分隔使得该抗性基因失活。 (3)步骤是 的过程,为了促进该过程,应 该用 处理大肠杆菌。 (4)步骤将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基C上培养,目 的是筛选 ,能在C中生长的大肠杆菌有,种。 (5)步骤:用无菌牙签挑取C上的单个菌落,分别接种到D(含氨苄青霉 素和四环素)和E(含四环素)两个培养基的相同位置上,一段时间后,菌落 的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于 (填“D”或 “E”)上,请在图中相应的位置上圈出来。,答案 (1)限制性核酸内切酶 DNA连接酶 (2)氨苄青霉素抗性 (
22、3)将重组质粒(目的基因)导入大肠杆菌(受体细胞) CaCl2溶液 (4) 含四环素抗性基因的大肠杆菌(回答含抗性基因的大肠杆菌给分,回答 含目的基因的大肠杆菌不给分) 2 (5)E (评分标准:在两个菌落中圈 一个也可给分),解析 (1)形成重组DNA分子需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接 酶两种工具酶。(2)由图可知,有些质粒上的氨苄青霉素抗性基因被切 开并接入了外源目的基因。(3)步骤是将重组质粒(目的基因)导入大 肠杆菌(受体细胞)的过程;应用CaCl2溶液处理大肠杆菌增加大肠杆菌细 胞壁的通透性,利于重组质粒进入大肠杆菌。(4)步骤的目的是筛选 含四环素抗性基因的大肠杆菌,能在C中
23、生长的大肠杆菌有2种,一种是 含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌,另一种是含有 四环素抗性基因和目的基因的大肠杆菌。(5)含有目的基因的大肠杆菌,不抗氨苄青霉素,不能在含有氨苄青霉素的培养基中生长,因此含有目 的基因的菌落存在于E上。,1-2 科研人员拟将已知的花色基因(目的基因)转入矮牵牛的核基因组 中,培育新花色的矮牵牛。请回答: (1)为了获得大量的目的基因,将其与含有抗生素抗性基因的质粒DNA 形成重组DNA,再与经 (A.氯化钙 B.氯化钠 C.蔗糖 D.葡萄 糖)处理的大肠杆菌液混合,使重组DNA进入大肠杆菌。 (2)从扩大培养的大肠杆菌中提取含有目的基因的DNA,用
24、 分别切割含目的基因的DNA和农杆菌的Ti质粒,然后用 DNA连接酶连接,形成重组DNA并导入农杆菌。,(3)提取叶片组织的DNA,采用PCR技术 目的基因,鉴定目的基 因是否成功导入。 (4)为判断本研究是否达到预期目的,可比较转基因植株和非转基因植 株的 性状。,答案 (1)A (2)限制性核酸内切酶 (3)扩增 (4)花色,解析 (1)用氯化钙处理大肠杆菌,使大肠杆菌处于感受态,使重组DNA 能够进入大肠杆菌,完成重组DNA的导入。(2)用限制性核酸内切酶分 别切割含目的基因的DNA和农杆菌的Ti质粒,然后用DNA连接酶连接, 形成重组DNA分子。(3)采用PCR技术可对特定DNA片段进
25、行扩增。 (4)检测转基因植物中目的基因的表达情况,可以对转基因植物个体的 相应性状变化进行鉴定,本研究中可以比较转基因植株和非转基因植株 的花色来鉴定。,考点二 基因工程的应用,1.基因工程在育种中的应用 (1)传统育种技术与转基因技术的比较,(2)转基因植物的产生过程(以转基因烟草的培育过程为例)(3)转基因动物的产生过程(以转基因牛“滔滔”的培育过程为例),2.基因诊断和基因治疗 (1)基因诊断 方法:DNA分子杂交法(即DNA探针法),该方法是根据碱基互补配对 原则,把互补的双链DNA解开,把单链的DNA小片段用同位素、荧光分 子或化学发光催化剂等进行标记,之后同被检测的DNA中的同源
26、互补 序列杂交,从而检出所要查明的DNA或基因。 步骤:抽取病人的组织或体液作为化验样品;将样品中的DNA分离出 来;用化学法或热处理法使样品DNA解旋;将事先制作好的DNA探针引,入化验样品中,这些已知的经过标记的探针能够在化验样品中找到互补 链,并与之结合(杂交)在一起,找不到互补链的DNA探针,则可以被洗 脱。这样通过对遗留在样品中的标记过的DNA探针进行基因分析,就 能检出病人所得的病。 (2)基因治疗 原理:利用正常基因纠正或补偿基因的缺陷的方案,即把正常基因导 入患者体内,使该基因的表达产物发挥功能,从而达到治疗疾病的目的, 而原有缺陷基因一般不作处理。,方法:有体外基因治疗和体内
27、基因治疗,体外基因治疗方法疗效较 好。如重度免疫缺陷症的体外基因治疗方法:体内基因治疗:用基因工程的方法,直接向人体组织细胞中转移基因。,典例2 将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中,可获得抗棉铃虫 的转基因棉,其过程如下图所示(注:农杆菌中Ti质粒上只有T-DNA片段 能转移到植物细胞中)。质粒中“Bt”代表“Bt基因”,“KmR”代表“卡那霉素抗性基因”,(1)过程需用同种 酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进 行酶切。为将过程获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来,应使用 培养基。 (2)过程中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养,旨在让 进 入棉花细胞;除尽农杆菌后,还需转接到含卡那霉素的培养
28、基上继续培 养,目的是 。 (3)若过程仅获得大量的根,则应在培养基中增加 以获得芽;部分接种在无激素培养基上的芽也能长根,原因是,。 (4)检验转基因棉的抗虫性状,常用方法是 。种植转基因 抗虫棉能减少 的使用,以减轻环境污染。解题关键 掌握基因工程的基本操作步骤,并能在具体实践中运用,同 时考查了植物激素的作用。,答案 (1)限制性核酸内切 选择 (2)T-DNA 筛选获得T-DNA片段 的植物细胞 (3)细胞分裂素浓度 芽顶端合成的生长素向基部运输, 促进根的分化 (4)投放棉铃虫 农药,解析 本题考查基因工程与植物细胞工程的相关知识。(1)用同种限制 酶切割质粒和含目的基因的DNA,可
29、获得相同的粘性末端,以构建基因 表达载体。重组质粒含完整的卡那霉素抗性基因,故应使用含卡那霉素 的选择培养基筛选含重组质粒的农杆菌。(2)实验过程中将棉花细胞与 农杆菌混合后共同培养,其目的是利用含重组质粒的农杆菌将T-DNA 导入棉花细胞中。除去农杆菌后在含卡那霉素的培养基上培养,其目的 是筛选出含有目的基因的棉花细胞。(3)培养基中生长素用量与细胞分 裂素用量比值高时,利于根的分化,抑制芽的形成,反之,有利于芽的分化,抑制根的形成。因芽顶端可合成生长素,故接种在无激素的培养基上的 芽也能长根。(4)可用投放棉铃虫的方法检测抗虫棉的抗虫效果。转基 因抗虫棉的种植可减少农药使用量,从而减轻环境
30、污染。,2-1 干扰素是治疗癌症的重要药物,它必须从血液中提取,每升人血中 只能提取0.5 g,所以价格昂贵。美国加利福尼亚的某生物制品公司用 如下方法生产干扰素。如图所示:从上述方式中可以看出该公司生产干扰素运用的方法是 ( B ),A.个体间的杂交 B.基因工程 C.细胞融合 D.器官移植,解析 从题图中可以看出整个过程为将人的淋巴细胞中控制干扰素合 成的基因与质粒结合后导入酵母菌,并从酵母菌产物中提取干扰素,这 项技术为基因工程。,2-2 胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1是该方 法所用的基因表达载体,图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛 素的基本流程(融合蛋白A、
31、B分别表示-半乳糖苷酶与胰岛素A、B链 融合的蛋白)。请回答下列问题:,图1,图2 (1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是 。 (2)图1中启动子是 酶识别和结合的部位,有了它才能启动目的,基因的表达;氨苄青霉素抗性基因的作用是 。 (3)构建基因表达载体时必需的工具酶有 。 (4)-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达,可将胰岛素肽链上蛋白 酶的切割位点隐藏在内部,其意义在于 。 (5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键,用溴化氰处理相应的,融合蛋白能获得完整的A链或B链,且-半乳糖苷酶被切成多个肽段,这 是因为 。 (6)根据图2中胰岛素的结构,请推测每个胰岛素分子中所含游离
32、氨基的 数量。你的推测结果是 ,理由是 。,答案 (1)终止子 (2)RNA聚合 作为标记基因,将含有重组质粒的大 肠杆菌筛选出来 (3)限制酶和DNA连接酶 (4)防止胰岛素的A、B链 被菌体内蛋白酶降解 (5)-半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸,而胰岛 素A、B链中不含甲硫氨酸 (6)至少2个 两条肽链的一端各有一个游 离的氨基,氨基酸R基团中可能还含有游离的氨基,解析 (1)完整的基因表达载体应包含目的基因、启动子、终止子、标 记基因等,图1中没有标注出终止子。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结 合的部位,可驱动转录出mRNA;氨苄青霉素抗性基因属于标记基因,可 利用含氨苄青霉素的培养基筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。(3)构建 基因表达载体需用限制酶分别切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶 将两者连接形成重组质粒。(4)利用-半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链 融合表达的意义是将胰岛素肽链上的蛋白酶切割位点隐藏在-半乳糖 苷酶内部,从而防止胰岛素A链或B链被大肠杆菌内的蛋白酶降解。(5),根据溴化氰的作用特点可知,溴化氰可将-半乳糖苷酶切成多个肽段, 但不会切割胰岛素A、B链,这与肽链中含有的甲硫氨酸数量有关。(6) 由于每条肽链的一端都含有一个游离的氨基,所以蛋白质分子中游离氨 基的数量=肽链数+R基上游离氨基数,故可推测胰岛素(由A、B链组成) 至少含有2个游离的氨基。,
