1、- 1 -基因工程的基本操作程序一、基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定。二、目的基因的获取1从基因文库中获取(1)基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多 DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。(2)基因文库的种类：基因组文库：包含一种生物的所有基因。部分基因文库：包含一种生物的一部分基因。2利用 PCR 技术扩增(1)原理：DNA 双链复制。(2)过程：3人工合成(1)条件：基因比较小，核苷酸序列又已知。(2)方法：通过 DNA 合成仪用化学方法直接人工合成。三、基因表达载体的构建1构建
2、基因表达载体的目的1.基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。2将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。3将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2处理法)。4检测目的基因是否导入受体细胞常用 DNA 分子杂交技术；检测是否转录，常用分子杂交技术；检测是否翻译，常用抗原一抗体杂交技术。- 2 -(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。(2)使目的基因能够表达和发挥作用。2基因表达载体的组成填图四、将目的基因导入受体细胞1导入植物细胞(1)
3、农杆菌转化法：原理：农杆菌 Ti 质粒上的 TDNA 可整合到受体细胞的染色体 DNA 上。适用范围：主要适用于双子叶植物和裸子植物。(2)基因枪法：常用于单子叶植物。(3)花粉管通道法：目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。2导入动物细胞(1)常用方法：显微注射技术。(2)受体细胞：受精卵。3导入微生物细胞(1)方法：感受态细胞法，即用 Ca2 处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。(2)常用原核生物作为受体细胞的原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。五、目的基因的检测与鉴定1分子水平的检测连线2个体水平的鉴定(1)抗虫或抗病的接种实
4、验。(2)对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较。1基因工程主要操作步骤的顺序是( )- 3 -基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的获取A BC D解析：选 C 基因工程的主要操作步骤顺序是：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和鉴定。2基因工程的核心是( )A目的基因的获取B基因表达载体的构建C将目的基因导入受体细胞D目的基因的检测与鉴定解析：选 B 基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。3如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是( )A基因表达载体的构建是在生物体外完成的B任何基因表达载体的构建
5、都是一样的，没有差别C图中启动子位于基因的首端，是 RNA 聚合酶识别和结合的部位D抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因解析：选 B 由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方式不同，所以基因表达载体的构建也会有所差别，不可能千篇一律。4下列关于目的基因导入受体细胞的描述，错误的是( )A基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济和有效B显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法C大肠杆菌最常用的转化方法，是使细胞的生理状态发生改变D农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法解析：选 A 不同受体细胞导入目的基因的方法不同，每种方法都有
6、利弊。目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济和有效；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法；目的基因导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，完成转化。- 4 -5目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是( )检测受体细胞中是否有目的基因 检测受体细胞中是否有致病基因 检测目的基因是否转录出了 mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质A BC D解析：选 C 目的基因的分子检测包括三个方面：检测转基因生物的 DNA 上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA
7、分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了相应的 mRNA，方法也是使用基因探针与之杂交；检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质，常用的方法是抗原抗体杂交。Error!核 心 要 点 一 目 的 基 因 的 获 取 与 基 因 表 达 载 体 的 构 建1获取目的基因方法的比较基因文库的构建方法基因组文库部分基因文库(如 cDNA 文库)PCR 技术扩增 人工合成过程优点操作简单 专一性强可在短时间内大量扩增目的基因专一性强，可产生自然界中不存在的新基因缺点工作量大、盲目性大、操作过程较麻烦，技术要求需要严格控制温度、技术要适用范围小- 5 -专一性差 过高 求高2PCR 反应的过程3PCR 技术与
8、生物体内 DNA 复制的比较比较项目 PCR 技术 DNA 复制解旋方式 DNA 在高温作用下变性解旋 解旋酶催化场所 细胞外(在 PCR 扩增仪内) 细胞内(主要在细胞核内)酶 耐热的 DNA 聚合酶( Taq 聚合酶)DNA 解旋酶、普通的 DNA 聚合酶等温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 细胞内温和条件区别合成的对象 DNA 片段或基因 DNA 分子联系模板：均需要脱氧核苷酸链作为模 板进行物质合成原料：均为四种脱氧核苷酸酶：均需要 DNA 聚合酶进行催化引物：均需要引物，使 DNA 聚合酶 从引物的 3端开始连接脱氧核苷酸4基因表达载体的构建过程(1)用同一种限制酶切割目的基因和
9、质粒，使其产生相同末端。(2)将切下的目的基因片段与切开的质粒混合，再加入适量 DNA 连接酶，使目的基因插入质粒的切口处，形成一个重组 DNA 分子(重组质粒)。构建过程如下图所示：- 6 -题组冲关1(全国卷)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的 mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_。提取 RNA 时，提取液中需添加 RNA 酶抑制剂，其目的是_。(2)以 mRNA 为材料可以获得 cDNA，其原理是_。(3)若要使
10、目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_(答出两点即可)。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA 连接酶催化形成的化学键是_。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_。解析：(1)与老叶相比，嫩叶组织细胞易破碎，容易提取到几丁质酶的 mRNA。提取 RNA时，提取液中需添加 RNA 酶抑制剂，其目的是防止 RNA 降解。(2)以 mRNA 为材料获得 cDNA的原理是在逆转录酶的作用下，以 mRNA 为模板按照碱基互补配对的原则可以合成 cDNA。(3)若要使目的
11、基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点且目的基因无表达所需的启动子。(4)DNA 连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株不具备所期望的性状表现，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。答案：(1)嫩叶组织细胞易破碎 防止 RNA 降解 (2)在逆转录酶的作用下，以 mRNA 为模板按照碱基互补配对的原则可以合成 cDNA (3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子 (4)磷酸二酯键 (5)目的基因的转录或翻译异常2(海南高考)下图是将某细菌的基因 A 导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图
12、。据图回答：(1)获得 A 有两条途径：一是以 A 的 mRNA 为模板，在_酶的催化下，合成互补的单链 DNA，然后在_的作用下合成双链 DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的_序列，推测出相应的 mRNA 序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其 DNA 的_序列，再通过化学方法合成所需基因。(2)利用 PCR 技术扩增 DNA 时，需要在反应体系中添加的有机物质有_、_、4 种脱氧核糖核苷三磷酸和耐热性的 DNA 聚合酶，扩增过程可以在- 7 -PCR 扩增仪中完成。(3)由 A 和载体 B 拼接形成的 C 通常称为_。(4)在基因工程中，常用 Ca2 处理 D，其目的是_。解析：
13、(1)利用逆转录法合成目的基因的过程是：以 mRNA 为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链 DNA，然后在 DNA 聚合酶作用下，合成双链 DNA 分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的 mRNA 序列，然后按照碱基互补配对原则，推测 DNA 中脱氧核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。(2)PCR 过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。(3)目的基因和载体结合，形成基因表达载体。(4)在利用大肠杆菌作受体细胞时，需要先用 Ca2 处理，使之成为感受态细胞，有利于吸收重组DNA 分子。答案：(1)逆转录 DNA 聚合酶 氨基酸 脱氧核苷酸 (2
14、)引物 模板(A 基因) (3)基因表达载体 (4)使其成为感受态细胞，有利于吸收重组 DNA 分子Error!核 心 要 点 二 将 目 的 基 因 导 入 受 体 细 胞 及 目 的 基 因 的 检 测 与 鉴 定1将目的基因导入受体细胞的方法比较生物类型植物 动物 微生物受体细胞体细胞 受精卵 原核细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术 感受态细胞法转化过程以农杆菌转化法为例：将目的基因插入 Ti 质粒的TDNA 上转入农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的 DNA 上提取含目的基因的表达载体显微注射受精卵发育具有新性状的个体Ca2 处理细胞感受态细胞基因表达载体与感受
15、态细胞混合感受态细胞吸收 DNA 分子2目的基因的检测与鉴定归纳- 8 -3不同分子检测的原理、场所、探针的异同(1)进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组 DNA，而是转基因生物的细胞内的 mRNA；进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。(2)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。(3)在 DNA 分子、mRNA 分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的 DNA 片段。名师点拨 关注基因工程操作过程的四个易误点(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次
16、数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切 2 次，共产生 4 个黏性末端或平末端，切割质粒一般只需要限制酶剪切 1 次，产生 2 个黏性末端或平末端，因为质粒是环状 DNA 分子，而目的基因在 DNA 分子链上。(2)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶：如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在 DNA 连接酶的作用下，目的基因与载体也可以连接起来。(3)目的基因的插入点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。(4)基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象；第一步利用逆转录法获得 DNA，第二步中的
17、黏性末端连接，第四步利用分子水平杂交的方法检测，均存在碱基互补配对现象。题组冲关3(重庆高考)如图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是( )A的构建需要限制性核酸内切酶和 DNA 聚合酶参与B侵染植物细胞后，重组 Ti 质粒整合到的染色体上C的染色体上若含抗虫基因，则就表现出抗虫性状D只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异- 9 -解析：选 D 构建重组质粒需要限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶，不需要 DNA 聚合酶。含重组 Ti 质粒的农杆菌侵染植物细胞后，重组 Ti 质粒的 TDNA 整合到受体细胞的染色体上，而不是重组 Ti 质粒整合到受体细胞的染色体上。导
18、入受体细胞的目的基因表达后，转基因植株方能表现出相应性状，若目的基因在受体细胞中不表达，转基因植株不能表现出相应性状。表现出抗虫性状则表明该植株细胞发生了基因重组，基因重组是可遗传变异。4(天津高考)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组 HSA(rHSA)的两条途径。(1)为获取 HSA 基因，首先需采集人的血液，提取_合成总 cDNA，然后以 cDNA 为模板，使用 PCR 技术扩增 HSA 基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水
19、稻胚乳细胞内特异表达 rHSA 的载体，需要选择的启动子是_(填写字母，单选)。A人血细胞启动子 B水稻胚乳细胞启动子C大肠杆菌启动子 D农杆菌启动子(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是_。(4)人体合成的初始 HSA 多肽，需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径相比，选择途径获取 rHSA 的优势是_。(5)为证明 rHSA 具有医用价值，须确认 rHSA 与_的生物学功能一致。解析：(1)要想合成总 cDNA，需要采集人的血液获得总 RNA。由于 DNA 的复制只能从脱氧核苷酸单链的 5端向 3端延伸，因而引物均应结合在 DNA 单链的 3端，而
20、DNA 的两条链反向平行，由此可以确定引物在另一条脱氧核苷酸单链的位置和方向。(2)若要从水稻胚乳细胞内获得目的产物，需要控制该目的基因只在水稻胚乳细胞内表达。由题干中的信息“启动子通常具有物种及组织特异性”可知，此处需要选择水稻胚乳细胞启动子。(3)酚类物质能吸引农杆菌，因此在水稻受体细胞中添加该类物质，能吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因的成功转化。(4)途径和的主要区别是途径的受体细胞是真核细胞，途径的受体细胞是原核细胞。由于人体合成的初始 HSA 多肽需要经膜系统加工形成正确的空间结构才有生物活性，所以选择途径获取 rHSA 更具有优势。(5)rHSA 是基因工程的产物，其是否
21、具有医用价值，还需要在个体水- 10 -平上进一步确认其与 HSA 的生物学功能是否一致。答案：(1)总 RNA(或 mRNA) 如图所示(2)B (3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化 (4)水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始 rHSA 多肽进行高效加工 (5)HSA随堂基础巩固 1下列获取目的基因的方法中需要模板链的是( )从基因文库中获取目的基因 利用 PCR 技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA 合成仪利用化学方法人工合成A BC D解析：选 D PCR 利用的是 DNA 双链复制原理，即将双链 DNA 之间的氢键打开，变成单链 DNA ，作为聚合反应的模板。反转
22、录法则是以目的基因转录成的 mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链 DNA，再合成双链 DNA。、均不需要模板。2下列关于基因表达载体及其构建的相关叙述，错误的是( )A基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分B目的基因主要是指编码所需蛋白质的结构基因C构建基因表达载体需用限制酶和 DNA 连接酶D构建基因表达载体必须在细胞内进行解析：选 D 一个基因表达载体的组成除目的基因外还必须具有启动子、终止子、标记基因等部分；目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因；基因表达载体的构建是目的基因与载体结合，在此过程中需用同种限制酶切割目的基因与载体，用 DNA 连接酶
23、将相同的末端连接起来；基因表达载体的构建是在细胞外进行的。3利用外源基因在受体细胞中表达可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因完成表达的是( )A棉花细胞中检测到载体上的标记基因B山羊乳腺细胞中检测到人的生长激素基因C大肠杆菌中检测到人的胰岛素基因转录出的 mRNAD酵母菌细胞中提取到人的干扰素解析：选 D 目的基因完成表达是指目的基因在细胞中合成相应的蛋白质，在酵母菌细胞中提取到人的干扰素，说明导入酵母菌中的人的干扰素基因完成了表达。4基因工程是在 DNA 分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，无需进- 11 -行碱基互补配对的步骤是( )A人工合成目的基因B基因表达载体
24、的构建C将目的基因导入受体细胞D目的基因的检测与鉴定解析：选 C 将目的基因导入受体细胞过程中没有进行碱基互补配对。5下面甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法错误的是( )A甲方法可建立该细菌的基因组文库B乙方法可建立该细菌的 cDNA 文库C甲方法需要 DNA 连接酶，而不需要限制酶D乙方法需要逆转录酶参与解析：选 C 甲方法是以细菌中的 DNA 为基础，用限制酶进行切割，获得细菌所有的基因，因此，可以建立基因组文库，并且能从中选出所需要的目的基因。乙方法是用逆转录的方法人工合成目的基因，通过这种方法只能得到生物的部分基因，组成的是该细菌的 cDNA文库。6抗菌肽对治疗
25、癌症有一定的作用，下图表示抗菌肽合成过程。相关说法正确的是( )A用 PCR 克隆目的基因不需要 DNA 解旋酶B基因表达载体包含起始密码和终止密码C用显微注射法导入基因表达载体D筛选菌种时用基因探针检测相关蛋白质解析：选 A PCR 技术中采用高温变性，因此用 PCR 克隆目的基因不需要 DNA 解旋酶；基因表达载体包括启动子和终止子，起始密码和终止密码在 mRNA 上；将基因表达载体导入酵母菌细胞时应用感受态细胞法；筛选菌种时用基因探针检测相关基因或 mRNA，不能用基因探针检测蛋白质。7白细胞介素是一类淋巴因子。研究人员将人白细胞介素的基因导入到酵母菌细胞中，使其分泌出有活性的白细胞介素
26、。- 12 -(1)为增加白细胞介素基因的数量，可使用_技术，但前提是必须知道基因的已知序列，目的是_。(2)在重组载体导入酵母菌细胞之前，需用_处理酵母菌，白细胞介素基因进入酵母菌细胞内，并且在其细胞内维持稳定和表达的过程，称为_。在表达过程中，启动子需与_识别和结合，从而驱动转录过程。(3)在体液免疫过程中，白细胞介素是由_细胞分泌的，为了能成功表达出白细胞介素，不使用细菌，而使用酵母菌细胞作为受体细胞，原因可能是_。(4)在分泌型表达载体和白细胞介素基因所在的 DNA 分子上均有多个限制酶的酶切位点，图示过程为获得有效表达的重组载体，使用了 EcoR1 和 EcoR52 两种限制酶，比使
27、用单一的限制酶，其优点是_。 解析：(1)基因工程中，扩增目的基因的方法为 PCR 技术，但前提是必须知道基因的已知序列，以便设计引物。(2)在重组载体导入酵母菌细胞之前，需用 Ca2 处理酵母菌，使酵母菌成为感受态细胞，白细胞介素基因进入酵母菌细胞内，并且在其细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。在表达过程中，启动子需与 RNA 聚合酶识别和结合，从而驱动转录过程。(3)在体液免疫过程中，白细胞介素是由 T 淋巴细胞分泌的；由于细菌属于原核生物，细胞中无内质网和高尔基体等加工白细胞介素的细胞器，因此为了能成功表达出白细胞介素，不使用细菌，而使用酵母菌作为受体细胞。(4)在分泌型表达载体和白细胞
28、介素基因所在的 DNA分子上均有多个限制酶的酶切位点，图示过程获得有效表达的重组载体使用了 EcoR1 和EcoR52 两种限制酶，比使用单一的限制酶，其优点是防止目的基因、表达载体发生自身环化或者防止目的基因反向接入到分泌型表达载体中。答案：(1)PCR 设计引物 (2)Ca 2 转化 RNA 聚合酶 (3)T 淋巴 细菌细胞中无内质网和高尔基体等加工白细胞介素的细胞器 (4)防止目的基因、表达载体发生自身环化或者防止目的基因反向接入到分泌型表达载体中课时跟踪检测 一、选择题1基因工程中因受体细胞不同，目的基因导入的方法也不同，下列叙述错误的是( )A将目的基因导入棉花细胞内常用花粉管通道法
29、B将目的基因导入老鼠细胞内常用显微注射法- 13 -C将目的基因导入大肠杆菌内常用感受态细胞转化法D将目的基因导入小麦细胞内常用农杆菌转化法解析：选 D 小麦是单子叶植物，其受伤后不能分泌酚类物质，农杆菌对它没有感染能力。2第三代疫苗DNA 疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因插入到适宜的质粒中得到的重组 DNA 分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫反应，且可持续一段时间。下列有关 DNA 疫苗的叙述，正确的是( )A表达产物不是抗原BDNA 疫苗生产过程不需要 DNA 解旋酶和限制酶C抗原基因在体内表达时不需要 RNA 聚合酶DDNA 疫苗的特异性与碱基种类无关解析：
30、选 D DNA 疫苗是编码抗原蛋白的基因，因此其表达产物是抗原；DNA 疫苗是指将编码抗原蛋白的基因插入到适宜的质粒中得到的重组 DNA 分子，可见其生产过程需要 DNA 连接酶和限制酶；基因在体内表达的转录过程中，需要 RNA 聚合酶催化；DNA 的特异性与碱基对的排列顺序有关，与碱基种类无关。3下图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。相关叙述正确的是( )A三种方法都需要酶并均在体外进行B碱基对的排列顺序均相同C三种方法均属于人工合成法D方法 a 不遵循中心法则解析：选 A 这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法 a 需要逆转录酶和 DNA 聚合酶；方法 b 需要限制酶；方法
31、 c 需要 DNA 聚合酶)；通过方法 a 得到的目的基因不含有内含子，通过方法 c 得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此碱基对的排列顺序不都相同；图示 a 和 c 属于人工合成法，而 b 是从供体细胞的 DNA 中直接分离目的基因的方法；方法 a 遵循中心法则。4下列有关基因工程的叙述，正确的是( )ADNA 连接酶只能将由同一种限制性核酸内切酶切割而成的黏性末端连接起来B目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变C目的基因与质粒结合的过程发生在细胞外D常使用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等解析：选 C DNA 连接酶可以将不同种限制性核酸内切酶切割形成的相同的黏性末端连接起来
32、；目的基因导入受体细胞后，受体细胞发生基因重组而不是基因突变；目的基因与质- 14 -粒结合形成重组质粒的过程发生在细胞外的环境中；在基因工程中，常使用的载体有质粒、 噬菌体的衍生物和动植物病毒等。5下列关于 cDNA 文库和基因组文库的说法，错误的是( )AcDNA 文库中的 DNA 来源于 mRNA 的反转录过程B如果某种生物的 cDNA 文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同CcDNA 文库中的基因都没有启动子D一种生物的 cDNA 文库可以有许多种，但基因组文库只有一种解析：选 B 由于基因转录时只有编码区段才能转录，所以以 mRN
33、A 反转录成的 DNA 就只有外显子区段，而缺少内含子和启动子等非编码区段，和原来的基因结构不相同。6科研人员先分别 PCR 扩增尿酸酶基因和原核生物胞外蛋白信号肽基因(编码的肽链能引导新合成的蛋白质转移、分泌)，再将它们拼接形成融合基因，并导入大肠杆菌生产尿酸酶。下列相关叙述错误的是( )A扩增两类基因时可以通过设计引物来控制两类基因的拼接方向B构建融合基因的目的是使大肠杆菌能合成尿酸酶并分泌到细胞外C融合基因导入大肠杆菌前需构建基因表达载体，以保证目的基因正常表达和遗传D在导入融合基因前，应先用 NaCl 处理大肠杆菌，使其变为感受态细胞解析：选 D 扩增两类基因时可以通过设计引物来控制两
34、类基因的拼接方向；构建融合基因的目的是使大肠杆菌能合成尿酸酶并分泌到细胞外；融合基因导入大肠杆菌前需构建基因表达载体，以保证目的基因正常表达和遗传；在导入融合基因前，应先用 CaCl2处理大肠杆菌，使其变为感受态细胞。7(重庆高考)下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是( )A表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞 mRNA 反转录获得B表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点C借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来D启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用解析：选 C 胰岛素基因只能在胰岛 B 细胞中表达，不能在肝细胞中表达，因而不能通过人体肝细胞 mR
35、NA 反转录获得。复制原点是表达载体复制的起点，胰岛素基因表达的起点是启动子。基因表达载体中一般以抗生素抗性基因为标记基因，因此可借助抗生素抗性基因将含有胰岛素基因的受体细胞筛选出来。终止密码子是翻译终止的信号，不是转录终止的信号。8如图是利用基因工程技术生产可食用疫苗的部分过程，其中Pst、 Sma、 EcoR、 Apa为四种限制性核酸内切酶。下列有关说法正确的是( )- 15 -A图示过程是基因工程的核心步骤，所需的限制性核酸内切酶均来自原核生物B图示中构建基因表达载体时，需要用到一种限制性核酸内切酶C一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列D抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗
36、原基因的细胞筛选出来解析：选 D 图示表示基因表达载体的构建过程，这是基因工程的核心步骤，所需限制酶一般来自原核生物；此表达载体构建时需要用到 EcoR、 Pst限制酶；限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列并在特定的位点切割；抗卡那霉素基因作为标记基因，主要作用是筛选含有目的基因的受体细胞。9若要利用某目的基因(图甲)和 P1 噬菌体载体(图乙)构建重组 DNA(图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是 Bgl(AGATCT)、 EcoR(GAATTC)和 Sau3A (GATC)。下列分析正确的是( )A用 EcoR切割目的基因和 P1 噬菌体载体B用 Bgl和 E
37、coR切割目的基因和 P1 噬菌体载体C用 Bgl和 Sau3A切割目的基因和 P1 噬菌体载体D用 EcoR和 Sau3A切割目的基因和 P1 噬菌体载体解析：选 D 解答本题的关键是要看清切割后目的基因插入的方向，只有用 EcoR和Sau3A切割目的基因和 P1 噬菌体载体，构建的重组 DNA 中 RNA 聚合酶在插入的目的基因上的移动方向才一定与图丙相同。10如图是将人的生长激素基因导入细菌 B 细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B 细胞内不含质粒 A，也不含质粒 A 上的基因。判断下列说法正确的是( )- 16 -A将重组质粒导入细菌 B 常用的方法是显微注射法B将完成导入过程后的
38、细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只有导入了重组质粒的细菌C将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A 的细菌D目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长解析：选 C 将目的基因导入细菌细胞中常用的方法是 Ca2 处理法。基因必须保持结构的完整性才能得以表达，而抗氨苄青霉素基因结构完整能够表达，从而使细菌具有对氨苄青霉素的抗性；在含有氨苄青霉素的培养基上能存活的是导入了质粒 A 或重组质粒的细菌。由于将人的生长激素基因插入到质粒的抗四环素基因上，破坏了抗四环素基因的完整性，因此，导入了重组质粒的细菌没有对四环素的抗性，在含有四环素
39、的培养基上不能存活，能存活的是导入了质粒 A 的细菌。目的基因成功表达的标志是受体细胞产生人的生长激素。二、非选择题11(江苏高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR 扩增过程示意图如下，请回答下列问题：(1)从高表达 MT 蛋白的生物组织中提取 mRNA，通过_获得_用于 PCR 扩增。(2)设计一对与 MT 基因两端序列互补配对的引物(引物 1 和引物 2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的_位点。设计引物时需要避免引物之间形成_，而造成引物自连。(3)图中
40、步骤 1 代表_，步骤 2 代表退火，步骤 3 代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR 扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但_的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果 PCR 反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_(填序号：升高退火温度 降低退火温度 重新设计引物)。- 17 -解析：(1)PCR 技术可在体外对 DNA 进行扩增，模板可以是 mRNA 经过逆转录获得的cDNA。(2)设计一对与 MT 基因两端序列互补配对的引物(引物 1 和引物 2)时，需在引物中增加适当的限制性核酸内切酶的识
41、别序列，便于目的基因与质粒的连接。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据 PCR 的过程可知，图中步骤 1 为变性，步骤 2 为退火(复性)，步骤 3 为延伸，这三个步骤构成一个循环。(4)退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，过高的退火温度会破坏引物与模板的碱基配对。因 G、C 之间的氢键数多于 A、T 之间的氢键数，故 GC 含量高的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果 PCR 反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高使扩增效率降低，也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，因此可以采取的措施是降低退火温度、重新设计引物等。答案：(1)
42、逆转录 cDNA (2)限制性核酸内切酶 碱基互补配对 (3)变性 (4)引物与模板 GC 含量高 (5)12内皮素(ET)是一种多肽，主要通过与靶细胞膜上的 ET 受体(ET A)结合而发挥生物学效应。科研人员通过构建表达载体，实现 ETA基因在大肠杆菌细胞中的高效表达，其过程如下图所示。图中 SNAP 基因是一种荧光蛋白基因，限制酶 Apa 的识别序列为 ，限制酶 Xho 的识别序列为 。请据图分析回答：(1)进行过程时，需要加入缓冲液、引物、dNTP 和_酶等。完成过程的目的是_。(2)过程和中，限制酶 Xho 切割 DNA，使_键断开，形成的黏性末端是_。(3)构建的重组表达载体，目的
43、基因上游的启动子是_的部位，进而可驱动基因的转录。除图中已标出的结构外，基因表达载体还应具有的结构是_。(4)过程要用 CaCl2预先处理大肠杆菌，使其成为容易吸收外界 DNA 的_细胞。(5)SNAP 基因表达的产物是一种荧光蛋白，将与 ETA基因结合构成融合基因，其目的是有利于检测_。- 18 -解析：(1)过程是以 mRNA 为模板合成 cDNA，因此需要加入缓冲液、引物、dNTP 和反转录(逆转录)酶等。完成过程的目的是获取目的基因(ET A基因)。(2)过程和中，用限制酶 Xho 切割 DNA，其目的是获取目的基因和切割质粒，在此过程中，磷酸二酯键断开，形成的黏性末端是 。(3)构建
44、的重组表达载体，目的基因上游的启动子是 RNA 聚合酶的识别和结合的部位，进而可驱动基因的转录。除图中已标出的结构外，基因表达载体还应具有的结构是终止子。(4)过程要用 CaCl2预先处理大肠杆菌，使其成为容易吸收外界 DNA 的感受态细胞。(5)SNAP 基因的表达产物是一种荧光蛋白，因此将SNAP 基因与 ETA基因结合构成融合基因，其目的是有利于检测 ETA基因能否表达及表达量。答案(1)反转录(逆转录) 获取目的基因(ET A基因) (2)磷酸二酯 (3)RNA 聚合酶的识别和结合 终止子 (4)感受态 (5)ET A基因能否表达及表达量13为了增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将酶
45、D 基因与转运肽基因相连，一起导入油菜细胞并获得了转基因油菜品种。(1)研究人员依据基因的已知序列设计引物，采用_技术快速扩增从陆地棉基因文库中获取到的酶 D 基因和从拟南芥基因文库中获取到的转运肽基因。所含三种限制酶(Cla、 Sac、 Xba)的切点如图所示，则用_酶处理两个基因后，可得到_端(填图中字母)相连的融合基因。(2)将上述融合基因插入如图所示 Ti 质粒的 TDNA 中，构建_并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含_的固体平板上培养得到含融合基因的单菌落，再利用液体培养基振荡培养，可以得到用于转化的侵染液。(3)剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是_，进一步筛选后获得转基因油菜细胞，该细胞通过_技术，可培育成转基因油菜植株。(4)用_法可检测转基因油菜植株中的融合基因是否表达。解析：(1)研究人员依据基因的已知序列设计引物，采用 PCR 技术从陆地棉基因文库中获取酶 D 基因，从拟南芥基因文库中获取转运肽基因。用 Cla限制酶和 DNA 连接酶处理两个基因后，可以得到 A、D 端相连的融合基因。(2)将上述融合基因插入图中所示的 Ti 质粒的 TDNA 中，构建基因表达载体(重组质粒)并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含四环素的固体平板上培养得到单菌落，再利用液体培养基振荡培养，可以得到用于转化的侵染液。
