1、ICS DB51 备案号：28195-2010 四川省地方标准 DB 51/T 11052010 动物棘球蚴病（包虫病）防治技术规范 Prevention and Control Norm for Animal Hydatidosis 2010 - 06 - 01 发布 2010 - 07 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 1105-2010 目 次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 诊断 1 5 疫情报告 2 6 疫情处置 2 7 防治 3 8 免疫 3 附录A（规范性附录） 犬科动物细粒棘球绦虫感染的剖检方法 4 附录B（规范性附
2、录） 犬棘球绦虫粪抗原检测 5 附录C（规范性附录） 牛羊血清抗体酶联免疫吸附试验（ELISA） . 6 DB51/T 1105-2010 前 言 本标准附录 A、附录 B、附录 C 为规范性附录。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省动物疫病预防控制中心负责起草。 本标准主要起草人：余勇、毛光琼、阳爱国、张永宁、郭莉、陈斌、张代芬、吴宣、李春、邓永强、邢坤、罗毅 DB51/T 1105-2010 动物棘球蚴病（包虫病）防治技术规范 1 范围 本规范规定了动物棘球蚴病（包虫病）的诊断、疫情报告、疫情处置、防治技术。 本规范适用于四川省境内从事
3、犬类和家畜饲养、屠宰、加工以及动物防疫活动的单位和个人。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB17013 包虫病诊断标准及处理原则 中华人民共和国动物防疫法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 棘球蚴病（包虫病）Animal Hydatidosis 棘球绦虫的幼虫寄生在人体内引起的人兽共患寄生虫疾病，在我国有两种，即囊型包虫病和的泡型包虫病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为多种动物共患病，我国将其列为二类动物疫病。 3.2 囊型包
4、虫病 Cystic Hydati d Disease（CHD） ，Cystic Echinococcosis（CE） 由细粒棘球绦虫（Echinococcus g ranulosus）的幼虫寄生而引起的疾病。 3.3 泡型包虫病 Alveolar hHydatid Disease（AHD） ，Alveolar Echinococcosis（AE） 由多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）的幼虫寄生而引起的疾病。 4 诊断 4.1 流行特点 该病病原是棘球绦虫（Echinoc occus） 。分为细粒棘球绦虫（E.granulosus）、多房棘球绦虫（E.mult
5、ilolocularis） 、少节棘球绦虫（E.oligarthus） 、福氏棘球绦虫（E.vogeli） 、石渠棘球绦虫（E.shiquicus）5 个种。 DB51/T 1105-2010 终末宿主主要是犬、狼、狐狸等，绦虫（成虫）寄生于小肠；中间宿主主要是牦牛、绵羊、山羊、马、猪等哺乳动物，人也是易感宿主，包蚴多寄生于肝脏、肺等器官。绵羊、牦牛是棘球蚴最适中间宿主；该病主要分布在牧区和半农半牧区。虫卵随感染犬粪便排出，借助于空气尘埃污染饲草、饲料、水源、用具，中间宿主通过食入虫卵被感染。犬类常因摄入未经处理的病畜内脏被感染。 4.2 临床症状 本病为慢性寄生虫病。犬科动物一般无明显临床症
6、状，感染严重时病犬消化不良、腹泻、消瘦；草食家畜因棘球蚴寄生的部位和数量不同而出现不同症状，一般表现为消瘦、呼吸困难、咳嗽等；当大量寄生于肝脏时，叩诊时浊音区扩大，腹右侧膨大，触诊病畜表现疼痛。 4.3 病理变化 肝、肺等脏器可见大小不等的囊状突起，也可在脾、肾、肌肉、皮下等多处发现包囊。包囊分两层，外层为纤维层，内层为生发层，包囊内充满液体，液体沉淀后用肉眼或在解剖镜下可见许多生发囊与原头蚴。 4.4 诊断 4.4.1 病原学诊断 4.4.1.1 犬科动物绦虫检测 剖检犬只，观察犬小肠内是否有棘球绦虫成虫及其感染程度。剖检和虫体鉴定方法见附录 A。还可以通过氢溴酸槟榔碱对犬只导泻，检查排泄物
7、中有无棘球绦虫虫体。 4.4.1.2 家畜包虫病检测 剖检重点检查肝、肺和肾等实质器官，发现棘球蚴包囊，可判定为包虫病。若肉眼不能鉴别，可经病理切片检查确认包囊性质。 4.4.2 免疫学诊断 犬粪抗原检查法 可在感染犬粪便中查出棘球绦虫虫体代谢物或分泌物及虫卵抗原。 粪抗原检查法具体操作程序见附录B。 4.4.3 家畜酶联免疫吸附试验（ELISA） 可检测牛羊等中间宿主动物的血清抗体水平。ELISA 检查法具体操作程序见附录 C。 4.5 结果判定 符合 4.1、4.2 和 4.4.2 结果阳性者判为疑似；符合 4.3 和 4.4.1，发现成虫和棘球蚴时判定为患病动物。 5 疫情报告 任何单位
8、和个人发现疫情后，应按有关规定及时报告。 6 疫情处置 6.1 对感染家犬进行隔离，限制其活动，严禁将未经无害化处理的脏器喂犬。对无主犬或流浪犬应在动物卫生监督机构的监督下进行扑杀并作无害化处理；对家犬，用吡喹酮每月驱虫 1 次，其犬粪进行无害化处理，防止虫卵污染环境；场地应用 10%的氢氧化钠溶液喷洒或进行火焰消毒。 6.2 对病畜脏器进行无害化处理，严禁未经煮熟的脏器喂犬。 7 防治 DB51/T 1105-2010 7.1 犬的防治 7.1.1 犬驱虫-吡喹酮药饵驱虫法 按犬体重每公斤体重510mg的剂量一次性口服，每46w驱虫一次，一年812次。如用吡喹酮药饵，可按大型犬1片，小型犬半
9、片的剂量投药。在投药的前1d，家犬禁食，然后将药片夹在食物中（如馒头、肉等）给予，即可吞食。确认犬吞服后在犬驱虫登记卡上进行记录。 7.1.2 驱虫后的犬粪处理 犬驱虫后5d内，收集犬粪进行无害化处理（深埋或焚烧），防止虫卵污染环境。 7.1.3 建立犬驱虫登记卡 对流行区的所有家（牧）犬应进行登记，登记的内容包括：户主姓名、犬的性别、年龄、毛色、每次驱虫的日期等。 7.1.4 疫情呈爆发流行时，可捕杀无主犬。 8 免疫 用动物包虫病疫苗对流行区牛、羊等中间宿主动物进行一年两次免疫，防止牲畜感染。 8.1 屠宰环节控制 8.1.1 严禁在屠宰场内养犬，并防止犬进入屠宰场。 8.1.2 加强牛羊
10、屠宰检疫工作，屠宰检疫率达 100%。 8.1.3 对病变脏器实施高温高压、焚烧或深埋等无害化处理。严禁出售。 8.1.4 动物肉及其内脏加工熟化后食用。 DB51/T 1105-2010 AA 附 录 A （规范性附录） 犬科动物细粒棘球绦虫感染的剖检方法 A1 材料的采集和保存 犬科动物死亡后尽快取下小肠，将两端扎紧，放入已编号的塑料袋或金属容器内，尽快送往实验室。长距离运输时，可将材料袋搁置于冰块上，或将小肠扎好浸泡在固定液内（4-10%的甲醛溶液） ，也可将固定液注入肠腔内。对未固定的材料要尽快检查，因为在 24h 内棘球绦虫被消化。未用固定液保存的材料可深冻待检。但应注意虫卵对低温的
11、抵抗力较强，在-70 度条件下 24h 才能被杀灭，固定液也不能杀死虫卵。 A2 虫体检查与计数 新鲜肠管分成均等的几段，浸泡在370C的温生理盐水中待检，附着在肠壁上的虫体可以用放大镜进行观察和计数。 为了精确计算感染强度，将未固定的小肠分成46段，将每段肠管纵向切开，浸泡在37度的温生理盐水30min，待虫体释放到盐水中，肠壁用刮铲刮一下，将肠内容用盐水冲洗几遍，所有材料煮沸，过筛（80100目）滤洗，以除去绝大部分有色颗粒材料。滤洗后的肠内容物和刮取物均放在黑色浅皿内，用放大镜或立体显微镜进行观察计数。 A3 虫体的固定与染色 固定时，用吸管吸掉容器中的上清液，注入冷甲醛液（约50C）或
12、F.A.A固定液浸没绦虫，绦虫应在固定液中固定至少12h。染色时，虫体在水中洗涤15min，然后直接置于迈耶尔氏副卡红（Mayer s Paracarmine）中染色12-24h。 染色后，将虫体浸泡在0.5-1%盐酸溶液中数秒钟，以洗去过多的染色剂。将染色过的虫体连续置于浓度递增（40%、50%、70%、85%、95%、99%）的乙醇溶液中脱水，每一浓度至少脱水15min，其中100%酒精溶液脱水两次。 A4 标本制作 脱水后，将虫体置于二甲苯中 10min，然后取出用甲基水杨酸酯（冬青油）透明。然后用加拿大树胶等标本封固液制成标本。 F.A.A 固定液： 95%乙醇 80ml 福尔马林（3
13、7-40%甲醛） 10ml 冰醋酸 5ml 迈耶尔氏副卡红（Mayers Paracarmine）染色液： 卡红酸 1.0g， 氯化铝 0.5g 氯化钙 4.0g， 70%乙醇 100ml （加热混合，直至配料溶解，然后过滤）。 DB51/T 1105-2010 BB 附 录 B （规范性附录） 犬棘球绦虫粪抗原检测 B.1 材料准备： 聚苯乙烯塑料反应板、离心机、10ml 离心管、1.5ml 离心管、一次性筷子、防水记号笔、包被液、酶结合物、封闭液、洗涤液、底物液、终止液、阴性对照粪液、阳性对照粪液、移液器、移液器吸头、恒温箱、恒温水浴锅等。 B.1.1 抗体包被反应板：用包被液将第一抗体按
14、要求稀释。每孔 100ul 加入聚苯乙烯塑料反应板孔中。将包被好的反应板置湿盒内 4oC 冰箱过夜。次日取出反应板，甩净孔中液体，然后用洗板机洗涤 3 次，每次 3min，每次每孔加洗涤液 300 微升。最后将板在毛巾或吸水纸上甩净拍干。每孔加 300ul 封闭液，置湿盒内 37oC 温箱温育 1h。取出反应板，甩净孔中液体，同前洗板 3 次，每次 3min。最后甩净拍干。包被好的反应板可以立即使用，也可以置-20oC 冻存备用。 B.1.2 粪样的收集：粪样收集前 1d 将犬拴好，次日清晨工作人员挑选新排出的粪便 1-2g 装在 5ml 的采样管中，标记、送检。对于在规定时间内未排便的犬，可
15、用粪采样器直接插入直肠采样。 B.1.3 粪液的提取：根据每管粪样量加 2 倍粪便体积左右的粪便保存液。注意：不要把粪管上的犬编号丢失。旋紧盖子，将粪管直立于试管架上，放在恒温水浴锅中，7080oC 加热过夜。次日取出粪管，扭开盖子，用一次性筷子将粪便内容物充分搅匀，将粪液 56ml 倒入一个 10ml 容量的离心管中，用防水记号笔在管壁写上犬的编号，平衡离心管，3000 rpm，离心 5min 后，取出粪管，将上清液 1.5ml 倒入带盖的 2ml 小离心管中，盖好，在管侧壁记好犬的编号，4oC 保存。 如果 3d 内不能开展试验，样本应保存于-20oC。 B.2 操作程序： B.2.1 记
16、录样品编号：使待检粪样与检测孔相对应。 B.2.2 平衡：将包被好的反应板和粪便提取液平衡至室温。 B.2.3 加样：每孔加入粪液 100ul，每个样品做双孔。阳性对照加 1 孔、阴性对照加 3 孔，另留 1 孔加粪便保存液，100ul/孔。 板条置湿盒在 37度温箱中放置 1h。 B.2.4 洗涤：取出板条甩净孔中液体，然后用洗板机洗涤 3 次，每次 3min。每次每孔加液 300 微升。最后将板在毛巾或吸水纸上甩净拍干。 B.2.5 加酶标物：用封闭液将含酶标记的第二抗体按要求稀释至工作浓度，每孔 100ul，同前放置 37温箱 1h。 B.2.6 洗涤：取出板条甩净孔中液体，同前洗板 3
17、 次，每次 3 分钟。最后甩净拍干。 B.2.7 显色：每孔加底物显色液 100ul，置 370C 避光 15min。 B.2.8 终止： 每孔加终止液 50ul，轻轻晃动板条，混匀。 B.2.9 读板：打开酶标仪，预热 3min，同时打开电脑，找到检测程序，设定波长 450nm, 将检测板置于板架上， 先用空白孔调零，然后测定各孔吸光度（A450 nm） 。 B.3、结果判断： 阳性阈值计算：2.1 倍阴性对照 A450 nm 平均值 如果样品双孔 A450 nm 平均值阳性阈值，结果判为阳性；如果样品双孔 A450 nm 平均值阳性阈值，结果判为阴性。 DB51/T 1105-2010 C
18、C 附 录 C （规范性附录） 牛羊血清抗体酶联免疫吸附试验（ELISA） C.1 材料准备： C.1.1 抗原 包虫囊液纯化抗原（磷钨酸、氯化镁沉淀法制备）。 C.1.2 待检血清 无菌采血，分离血清。 C.2 操作方法 C.2.1 抗原包被聚苯乙烯板：用 005mo1LpH96 碳酸缓冲液稀释抗原至最适浓度，每凹孔加入 100L，置温盒。4过夜（或 1224h） ，次日，倾去抗原，用含 005吐温 20 磷酸缓冲盐水（001molL，pH74PBST）洗涤 3 次，每次 5min，甩干。 C.2.2 加待检血清：血清用 PBST 作 1200 稀释，每凹孔加入 100L，每板应设参考阳性一
19、孔，参考阴性三孔及 PBS 对照一孔。置温盒，371h，然后取出，倾去血清，洗涤同前。 C.2.3 加结合物：加入用 PBST 作 工作稀释度的辣根过氧化物酶（HRP）标记结合物 100L，37，1h 倾去结合物，洗涤同前。 C.2.4 加底物：通常加邻苯二胺（OPD）底物溶液（10mg OPD 25mL pH50 柠檬酸缓冲液30H(下标始)2(下标终)O(下标始)2(下标终)10L）100L，37，30min。 C.2.5 加中止液：2molLH(下标始)2 (下标终)SO(下标始)4(下标终)50L。 C.3 结果判断 在酶标专用比色计上读取 492nm OD 值，以待测样本（S）对阴性对照血清（N）的 SN 值21为阳性临界值。
