1、ICS 11. 04日.1 C 30 中华人民共和国国家标准GB/T 16886. 5-2003/ISO 10993-5: 1999 代替GBjT16886. 5-1997 医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验Biological evaluation of medical devices一Part 5: Test for in vitro cytotoxicity (150 10993-5: 1999 , IDT) 2003-03-05发布2003-08-01实施80 中华国家质民共和国督检验检在总局发布GB/T 16886. 5-2003/1SO 10993-5, 1999 前言G
2、B!T 16886的本部分等同采用国际标准ISO10993-5 , 1999(医疗器械生物学评价第5部分.体外细胞毒性试验队本部分第二版经技术修订取代第一版(GB!T16886.5-1997)，其主要修订内容除了试验方法中有一些细微改动外，样品制备按GB/T16886. 12-2000(医疗椿械生物学评价第12部分s样品制备与参照材料HidtISO 10993-12，1996)。GB/T 16886的总题目是医疗器械生物学评价，由下列部分组成g第1部分z评价与试验g第2部分z动物保护要求，一一第3部分2遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验F-一第4部分z与血液相互作用试验选择;第5部分g细胞毒性试验
3、s体外法g-一第6部分g植人后局部反应试验，第7部分2环氧乙烧灭菌残留量:第8部分2生物学试验参照材料的选择与定量指南(待出版), 第9部分2潜在降解产物的定性与定量框架;一一第10部分z剌激与致敏试验$一一第11部分z全身毒性试验p一一第12部分s样品制备与参照样晶s一一第13部分z聚合物降解产物的定性与定量;一一第14部分s陶瓷降解产物的定性与定量事一一第15部分z金属与合金降解产物的定性与定量;第16部分=降解产物与可沥滤物毒性动力学研究设计。有关其他方面的生物试验将有其他部分的标准。本部分由国家药品监督管理局提出。本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会归口。本部分起草单位z国家
4、药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心。本部分主要起草人=由少华、王昕、黄经春、钱承玉、郝树彬。81 , GB/T 16886.5-2003/150 10993-5: 1999 冒l言体外细胞毒性试验具有通用性，广泛适用于各种医疗器械和材料的评价.因此，本标准的目的，不是规定一个单一的试验方法，而是规定一个试验方案，需要在一系列试验步骤中判断，以选出最合适的试验.试验分成三类E浸提液试验、直接接触试验、间接接触试验。根据被评价样品的性质、使用部位和使用特性选择这些试验中的-类或几类。试验的选择决定了供试样晶的制备方法、培养细胞的制备以及细胞与样品或其浸提掖接触的方法。接触试验结束时，对细胞
5、毒性作用和程度进行评价。本部分放开了对评价方式的选择。这一指导思想引出多种通用试验，反映了许多提倡体外生物学试验团体的观点。细胞毒性测定中所使用的大量方法和终点测量方法可分成以下评价类型2al 按形态学方法评价细胞破坏gbl 细胞损伤的测定:。细胞生长的测定，dl 细胞代谢特性的测定。在这四种类型中，每一类都有几种可供选择的方法，研究者应了解试验的分类及其相应的专项技术，以便与其他类似器械或材料的结果具有可比性，以使各实验室间的试验具有可比性 82 GB/T 16886. 5-2003/ISO 10993-5: 1999 医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验1 范围GB/T 16886
6、的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育gu 用器械的浸提液，和/或b) 与器械接触.这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过GBjT16886的本部分的引用而成为本部分的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GBjT 16886. 1 医疗器械生物学评价第1部分s评价与试验(GB/T1688
7、6. 1-2l.idtl回10993-1,1997) GB/T 16886. 12-2000 医疗器械生物学评价第12部分z样品和J备和参照材料(idt150 10993 12:1996) 3 术语与定义3. 1 3.2 GB/T 16886. 1/ISO 1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。阴性对照材料E咽tivenlrolmalerial 按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。注.阴性对照的目的是撞证背景反应，例如高密度摩乙烯已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化铝陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照楠.阳性对照材料阳illveconlrol malerial 按照本部分试验时
8、可重现细胞毒性反应的材料。注z阳性对照的目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯已用作固体材料和漫提液的阳性对照，酷的稀释穰用于漫提模的阳性对照.)高密度聚乙烯可从美国药典委员会恨但如iUe，地rYI阻d，USAl和Ha国皿研究所食品和药品安全中心(Ochi四729-5，H四晤.wa257-J.阳。获得.提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但lSO对使用该产品不提供担保.的有机锢聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortex Ltd , Hy由e，Kent.CT216JL，UK(产品号码499-300-O00l获得.ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙西可从Hatano研究所食品
9、和药品安全中心Och皿729-5，Hanagawa257-Japan)获得.提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保.83 GB/T 16回6.5-2003118010993-5.1999 3.3 3.4 3.5 试剂对照reagent control 在不加试验材料的条件下，按授提条件和试验步骤得到的浸提介质p注E在本部分中，该定义取代GB/T16886.12月SO.J0993-12中3.1始出的定义.培养皿cultore v，酣睡Is适用于细胞培养的器皿，包括玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。注E在这些试验方法中，这些器皿只要将告组织培
10、养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养，可以互换使用.近汇合subconfl田ncy在对数生长期末，约80%的细胞汇合。4 样晶制备4. 1总. J 供试晶可选用sa) 材料浸提掖$和/或b) 材料本身回样晶制备应符合GB/T16886. 12/ISO 10993-120 4.2 材料漫提渡的制备4. 2. 1 漫提原则为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验树料发生诸如熔化、溶解或化学结掏改变等明显变化.注2霞提液中任何肉源性或外嚣性物质的I$!度及真接触试验细胞的量取决于接触面椒、漫提体积、pH、化学槽解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素.4.
11、2.2 漫提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种榕剂。对浸提介质的选择应进行验证=a) 含血清培养基;b) 无血清培养基gc) 生理盐水溶液gd) 其他适宜的潜剂.注E榕剂的选择应反映出漫提前目前，并应考虑使用极性和非极性两种糟剂.适宜的槽Jl!J包括纯革、植物油、二甲基亚飘(DMSO在所选择的测试革统中，如DMSO浓度大于0.5%(体棋分数)，则有细胞毒性.4.2.3 漫提条件4.2.3. 1 浸提应使用无菌技术，在无商、化学惰性的封闭容据中进行，应符合GB/T16886. 12/ ISO 10993-12的基本要求.4.2. 3.2 推荐的浸提条件是za) 37 C:I: 2C下不少
12、于24h, b) 50C土2C下72h土2h , c) 70C士2C下24h土2h, d) 121 c土2C下1h土0.2ho 可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能采用4.2.3. 2al规定的授提条件。4.2.3.3 浸提液用于细胞之前，如果进行过滤、离心或其他处置方法，最终报告(见第9章中应予以说84 GB/T 16886. 5-2003/ISO 10993严5，1999明，对授提液pH值的调整也应在报告中说明。对浸提液的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。4.3 直接接触试验材料的制备4.3. 1 在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态(
13、即液态或回态的材料未经修整即可进行测试。固体样晶应至少有一个平面D其他形状和物理状态的样品应进行调整。4.3.2 应考虑试验样品的无菌性.4.3.2.1 元菌器械试验材料的试验全过程应按元菌操作法进行。4.3.2.2 试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按元菌操作法进行。用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。4.3.2.3 试验材料如取自使用中不需要灭菌的器械，则应在供应状态下使用，但在试验全过程中应按无菌操作法进行，4.3.3 对掖体进行试验应za) 直接附着，或b) 附着到具有生物惰性和吸收性的基质上.注，!量腹是
14、适用的基质.4.3.4 对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透，以防止吸收试验器皿中的培养基，5 细胞票5. 1 优先采用己建立的细胞系并应从认可的贮源获取。5.2 在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性。5.3 细胞系原种培养贮存肘，应放在相应培养基内，在一80C或-80C以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚枫或甘油等。长期贮存(几月至几年)只能在-130C或-130C以下冻存.5.4 试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染，6 培鼻基6. 1 培养基应无菌.6.2 含血
15、清或元血清培养基应符合选定细胞系的生长要求.注z培养基中允许吉有对试验元不利影响的抗生素。培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关.含谷氨酸胶和血糟的培养基在2C8C条件下贮存不超过一周，含谷氨酸胶的无血清培养基在2C8C条件下贮存不超过2周.6.3 培养基的pH值应为7.27. 4. 7 细胞原种培养制备7. 1 用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞.使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用前至少传代培养一次.7.2 取出细胞，用适宜的酶分散法和/或机械分散法制备成细胞悬浮液。3)推荐的细胞系如CCLl(NCTC clone 929)、CCL163(Balb/3T3 clone A3
16、1)、CCL171(MRC-.白、CCL75(WI-38)、CCL 81(Vero)、CCL10BHK-21(巳13月和V-79379A.这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保.也可使用其他撞得出相同或更佳结果的细胞系.85 GB/T 16886. 5-2003/ISO 1日993-5:1999 B 试验步8. 1 平行样鼓至少采用三个平行试验样品数和对照数。8.2 漫提液试验8. 2. 1 该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.2.2 从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入与浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面回8.2
17、.3 根据培养基选择含或不含5%(体积分数)二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37C土2C温度下进行培养。试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度.8.2.4 试验前用显徽镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.2.5 试验可选用al 浸提原液;和bl 以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如采用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮掖制备好后立即将浸提液或上述稀释液加到每只平行器皿中-8.2.6 采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀释后应在最高生理相容浓度下试验。注z建议在稀释漫提藏时
18、使用浓罐的(如2倍、5倍培养基。8.2.7 加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器皿中。注E如需要，还可用新鲜培养基做对照试验，8.2.8 器皿按8.2. 3中所述同样条件进行培养，培养问期应符合选定方法的要求回8.2.9 经过至少24h的培养后，接8.5确定细胞毒性反应。8.3 直接接触试验8. 3. 1 该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.3.2 从持续搅拌的细胞悬捍液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样晶直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。8.3.3 根据培养基选择含或不含5%(体积分数)二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37C土2C温度下进行培养
19、，直至培养细胞生长至近汇合囚8.3.4 试验前用显徽镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.3.5 弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内。8.3.6 在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之一.操作时应注意防止样品不必要的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判断。注s如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内-8.3.7 同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。8.3.8 器皿按8.3.3中所述同样条件进行培养，培养间期(最少24h)应符合选定方法的要求。8.3.9 去除上层培养基，按8.5确定细胞毒性反应。8.4 闰接接
20、触试验8. 4. 1 琼蹦扩散试验8. 4. 1. 1 该试验用于细胞毒性定性评价，该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可洒滤物或与琼脂反86 GB月16886.5-2003/1SO 10993-5: 1999 应的物质。8. 4. 1. 2 从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入每只试验用平行器皿内，轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面B8.4.1.3 根据培养基选择含或不含5%(体积分数)二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37(;土2(;温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。8.4. 1. 4 试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8. 4. 1. 5 弃去器
21、皿中的培养基，然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合，使琼脂最终质量浓度为0.5%-2%，每只器皿内加入等量的该混合掖.只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂.该混合琼脂培养基应为液态，温度应适合于哺乳动物细胞。注:各种不同分子量和纯度的琼脂可通用E8.4. 1. 6 将试验样品轻轻放在每只器皿的困化琼脂层上，样晶应覆盖细胞层表面约十分之一。吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼Ii脱水。8. 4. 1. 7 同法制备阴性对照和阳性对照样品器皿。8.4. 1. 8 按8.4. 1. 3中所述的同样条件培养24h-72 h. 8.4.1.9 从琼脂上小心地取下样品之前、之后检测细胞
22、毒性.用活体染色剂如中性虹可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加人，如在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤.8.4.2 滤蹲扩触试验8.4.2.1 该试验用于细胞毒性定性评价。8.4.2.2 在数只试验用培养皿内，各放置一枚孔径。.45m、无表面活性剂的滤膜，并加入等量持续搅拌的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面。8.4.2.3 根据培养基选择含或不含5%(体积分数)二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37(;土2(;温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。8.4.2.4 试验前用显微镜检查培养细胞的近汇
23、合和形态情况.8.4.2.5 弃去培养器皿内的培养基，将滤膜细胞面向下，放在圃化的琼脂层上(见8.4. 1.的。8.4.2.6 轻轻将试验样品放到滤膜元细胞面的上面，滤膜上放置不产生反应的环，用以保留浸提液和新加入的成分。8.4.2.7 同法制备阴性和阳性对照样品滤膜。8.4.2.8 按8.4.2.3所述方法培养2h士10mn 8. 4.2. 9 轻轻从滤膜上取下样品，并从琼脂面上小心分离开滤膜。8.4.2.10 采用合适的染色程序确定细胞毒性反应.8.5 细胞毒性判定8.5. 1 可采用定性或定量方法检测细胞毒性。a) 定性评价z用显微镜检查细胞(如果需要，使用细胞化学染色)评价诸如一般形态
24、、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录，以下是给试验材料计分的有效方法。细胞毒性计分含义0 元细胞毒性1 轻微细胞毒性2 中度细胞毒性3 重度细胞毒性试验报告中应包括评价方法和评价结果。b) 定量评价s测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对细87 GB/T 16886. 5一2003/ISO10993-5, 1999 胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方法租测试结果应在试验报告中记录.注E有些栓测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基钱细胞培养对照.8
25、.5.2 应慎重选择评价方法，试验样晶如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效。注如评价细胞活力，部放甲霞的材料须经过可靠的试验验证.8.5.3 各平行培养器皿的检测结果如有显著差异，则判定试验不当或无效。8.5.4 阴性、阳性及任何其他对照物参照、培养基、空白、试剂等在试验系统中如无预期的反应，则应重新检测。9试验报告试验报告应详细包括以下所有内容za) 样晶的描述pb) 细胞系并对选择进行论证;c) 培养基sd) 评价方法和原理pe) 漫提步骤如必要)，如可能报告沥出物质的性质和浓度;f) 阴性、阳性和其他对照物sg) 细胞反应和其他情况，h) 结果评价所需的其他有关资料，10 结果评价应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做试验。88
