1、ICS 65.020.20CCS B 15DB21辽宁省地方标准DB21/T 41982025刺龙牙根腐病诊断及防治技术规程Technical regulation for diagnosis and control of Aralia elata root rotdisease2025-10-30 发布2025-11-30 实施辽宁省市场监督管理局发 布DB21/T 41982025I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省林业和草原局提出并归口。本文
2、件起草单位：辽宁省经济林研究所、辽宁省森林经营研究所。本文件主要起草人：郑泽洋、刘振盼、刘娟娟、孙俊、李玉莹、苏蕾、王克瀚、刘广平、卢立媛、张慧东、金鑫、高鹤、付钰、林晓坤、王学东、温福欣、常婧、李森远、商成林、穆怡陶、任万福。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省林业和草原局（辽宁省沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23448927。文件起草单位通讯地址：辽宁省经济林研究所（辽宁省大连市甘井子区中华西路31号），联系电话：0411-8651515
3、8。DB21/T 419820251刺龙牙根腐病诊断及防治技术规程1范围本文件规定了刺龙牙根腐病诊断及防治技术的术语和定义、病害诊断、病原菌鉴定、病害防治等技术要求。本文件适用于辽宁地区刺龙牙根腐病诊断及防治。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 8321.10 农药合理使用准则（十）GB 20287 农用微生物菌剂NY/T 496 肥料合理使用准则 通则NY/T 1276 农药安全使用规范准则3术语和定义下列术语和定义适用
4、于本文件。3.1刺龙牙 Aralia elata别名：刺嫩芽，为五加科楤木属多年生落叶小乔木。3.2刺龙牙根腐病 Aralia elata root rot disease由尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum Schltdl.和恶疫霉菌Phytophthora cactorum(Leb.et Cohn)Schroet引起刺龙牙根部腐烂的病害。4病害诊断4.1症状诊断根据病害田间症状特点初步判断病害种类，诊断标准见附录 A。4.2病原诊断DB21/T 4198202524.2.1主要仪器高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、光学显微镜、离心机、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统、涡旋振荡
5、器、全温振荡培养箱、超低温冰箱等。4.2.2主要培养基及试剂马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）、康乃馨叶片琼脂培养基（CLA）、大豆琼脂培养基（SA）、大豆汁培养基、无水乙醇、NaClO、真菌基因组 DNA 提取试剂盒、琼脂糖、50TAE 电泳液、DNA marker、2Es Taq MasterMix 等。4.2.3病原菌分离纯化采用组织分离法进行病原菌分离。选取感病植株的根组织，洗净晾干。从病健交界处切取 5 mm5mm 小块，放入 75%乙醇中浸泡 30 s，再置于 3%NaClO 中浸泡 2 min，后以无菌水清洗 3 次，在无菌滤纸上吸干残余水分后转入
6、培养基中培养，待培养物产生孢子后进行单孢分离，获得纯培养物。4.2.4病原菌培养及孢子形态观察将分离纯化后得到的病原菌转接于 PDA 或 SA 培养基中，25下黑暗培养 7 d，观察菌落形态及颜色。将病原菌转接于 CLA 或 SA 培养基中，25下黑暗培养 10 d-20 d，观察分生孢子、厚垣孢子、孢子囊、卵孢子大小及形态。4.2.5柯赫氏法则验证病原尖孢镰刀菌和恶疫霉菌接于 PDA 或 SA 培养基上生长 7 d 后，挑取边缘菌丝块至 PDB 或大豆汁液体培养基中，25、160 rpm/min 振荡培养 5 d-7 d，用血球计数板调整孢子液浓度为 1107个/mL；取50 mL 孢子液灌
7、根于刺龙牙植株根部，以 PDB 或大豆汁液体培养基为对照，温室培养 15 d 后观察刺龙牙发病情况；若发病症状与田间症状一致，则采集刺龙牙病根，再次进行病原菌分离培养，若与初分离获得的尖孢镰刀菌和恶疫霉菌相同，则为刺龙牙根腐病菌。5病原菌鉴定5.1形态学鉴定尖孢镰刀菌和恶疫霉菌的菌落形态、孢子形态见附录 B。5.2分子生物学检测5.2.1病原菌基因组 DNA 提取将病原菌接于 PDA 或 SA 培养基，待菌丝长满培养基后，刮取菌丝，使用试剂盒提取病原菌基因组DNA。5.2.2PCR 检测尖孢镰刀菌以 FOF1：5-ACATACCACTTGTTGCCTCG-3和 FOR1：5-CGCCAATCA
8、ATTTGAGGAACG-3为特异性引物，恶疫霉菌以 Ypt1F：ACGGAGAGCTACATCTCGAC 和 Ypt1R：GTCAGATCGCTCTTGTTACC 为特异性引物进行 PCR 扩增，PCR 反应体系见附录 C。5.2.3PCR 结果比对分析DB21/T 419820253取5 L扩增产物上样于1%琼脂糖凝胶电泳检测，尖孢镰刀菌和恶疫霉菌分别扩增出340 bp、482 bp单一DNA条带的为阳性结果，以不加入DNA模板且无对应DNA条带的为阴性结果。对扩增的DNA序列测序，在NCBI数据库Blast比对，待测菌株与尖孢镰刀菌或恶疫霉菌的序列相似性应大于99%。6病害防治6.1防治
9、原则遵循“预防为主，综合防治”的方针，优先采用物理和生物防治措施，合理使用化学农药，禁止使用高毒、高残留、未登记的农药，农药使用符合GB/T 8321.10和NY/T 1276的要求。6.2物理防治6.2.1合理选地选择土质肥沃、通透性和排灌性较好的壤土或沙壤土，并施用生石灰对土壤全面消毒处理。6.2.2选择繁殖材料种子繁殖应选用籽粒饱满的无病刺龙牙种子，无性繁殖选用无病虫害的一年生刺龙牙苗木，使用多菌灵等杀菌剂对繁殖材料消毒后种植。6.2.3合理施肥合理使用肥料，增施腐熟有机肥，氮磷钾合理配施，符合NY/T 496的要求。6.2.4保持卫生及时清除杂草，发现病株立即拔除，带出园外集中销毁，并
10、在病株周围土壤施入生石灰消毒。6.3生物防治种植前选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等生防菌剂，每亩1000 g-1500 g可湿性粉剂，与少量细土混匀后撒施在土壤表面，以预防根腐病的发生。发病初期，使用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌300-500倍液进行灌根处理，每株灌药量500 mL-1000 mL，每7 d-10 d灌根一次，连续灌2次-3次，防止病害扩展。生物制剂质量应符合GB 20287的要求。6.4化学防治高温高湿条件下，根腐病易发生，在发病初期进行病害防治。使用多菌灵、苯醚甲环唑、戊唑醇等药剂 500 倍液进行灌根处理，每株灌药量 500 m-1000 m
11、L，每 7 d-10 d 灌根一次，连续灌 2 次-3 次。7档案管理建立田间技术生产档案，对病害防治及其相关环节所采取的主要措施进行详细记录，档案保存期限不低于2年，做到可追溯。DB21/T 419820254附录A（资料性）刺龙牙根腐病田间症状及发病规律A.1 尖孢镰刀菌的为害症状及发病规律由尖孢镰刀菌引起的刺龙牙根腐病症状表现为发病初期根部出现黑褐色病斑，病斑逐渐扩展导致主根及须根内部组织腐烂，发病后期仅剩空的表皮，影响水分及养分运输，植株长势衰弱、地上部叶片逐渐变黄，枯萎，最终植株死亡。发病期为夏季7月-8月，高温高湿条件下发病较重，病原菌以菌丝体、厚垣孢子在土壤或病株上越冬，成为翌年
12、的初侵染源，病原菌通过雨水、流水、土壤、繁殖材料等方式传播，土壤黏重、透气性差的地块发病较重。图 A.1 尖孢镰刀菌为害症状A.2 恶疫霉菌的为害症状及发病规律由恶疫霉菌引起的刺龙牙根腐病症状表现为根部水渍状软腐，根表皮易脱落，木质部呈黑褐色，植株地上部叶片不变色、不脱落，但叶片似开水烫过呈水渍状萎蔫下垂，树势逐渐衰弱直至植株死亡。发病期为夏季7月-8月，病原菌以卵孢子在土壤或病株残枝上越冬，病原菌通过雨水、灌溉水、沾有带菌土壤的农具及带菌植株传播，排水不良的低洼地发病较重。图 A.2 恶疫霉菌为害症状DB21/T 419820255附录B（资料性）刺龙牙根腐病菌形态特征B.1 尖孢镰刀菌形态
13、特征尖孢镰刀菌生长速度较快，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上25培养7 d后菌落直径可达70-80mm，菌落圆形，气生菌丝茂盛呈白色或粉色絮状，菌落背面呈白色或粉色（图B.1A）。在康乃馨叶片琼脂培养基（CLA）上大型分生孢子呈镰刀状，2-5隔，20.57-33.753.62-6.11 m（图B.1B）。小型分生孢子呈卵状，0-1隔，5.12-13.533.04-4.79 m。厚垣孢子呈球状，平均直径为13.76 m（图B.1C）。图 B.1 尖孢镰刀菌形态特征B.2 恶疫霉菌形态特征恶疫霉菌在PDA培养基上生长缓慢，在大豆琼脂培养基（SA）上生长速度较快，25培养8 d后菌落直径可达70
14、80 mm，菌落圆形，菌丝呈白色（图B.2A）。在大豆琼脂培养上孢子囊顶生，呈近球形和卵形，大小为30.24（18.35-45.39）24.16（14.55-37.64）m，顶端有乳头状突起（图B.2B）。藏卵器球形，大小为27.03（21.06-35.90）m。雄器侧生，大小12.21（10.11-14.72）9.75（8.39-11.31）m（图B.2C）。图 B.2 恶疫霉菌形态特征DB21/T 419820256附录C（资料性）PCR 反应体系及扩增条件病原菌 PCR 反应体系（20 L）：10 L 2Es Taq MasterMix，1 L 基因组 DNA，正反向引物（10 M）各 1 L，超纯水补充至 20 L。PCR 扩增条件：95预变性 2 min；然后经 95变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 30 s，30 个循环；最后 72延伸 2 min。_
