1、ICS 65. 020. 30 B 41 道B中华人民共和国国家标准GB/T 28630.4-2012 白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分:组织病理学诊断法2012-07-31发布Diagnostic protocols for white spot disease一Part 4: Histopathology method 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2012-11-01实施发布GB/T 28630.4-2012 F.l1J I=l GB/T 28630(白斑综合征(WSD)诊断规程分为五个部分z一一第1部分z核酸探针斑点杂交检测法;一二第2部分z套式PC
2、R检测法;第3部分z原位杂交检测法;第4部分:组织病理学诊断法;一二第5部分:新鲜组织的T-E染色法。本部分为GB/T28630的第4部分。本部分按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本部分起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站。本部分主要起草人:黄佳、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦、刘莉。I GB/T 28630.4-2012 1 范围自班综合征(WSD)诊断规程第4部分:组织病理学诊断法GB/T 28630的本部分规定了白斑综合征组织病理学诊断法
3、所需试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本部分适用于对发病的对虾或其他敏感宿主的确诊和对怀疑染病宿主的诊断。本部分不适用于对潜伏性感染或病毒的非感染性携带的标本进行病毒检测。2 原理2. 1 白斑综合征的病原和病理学特征白斑综合征Cwhite spot syndrome)又称白斑病Cwhite spot disease)、白斑综合症、对虾暴发性流行病。白斑综合征具有发病急和死亡率高的特征，其症状是发病对虾停止摄食，反应迟钝，或卧于池边或在水面浮游，某些翻死对虾在甲壳上出现白色的斑块，有时伴随对虾腹节微微变红。白斑综合征的病原是自斑综合征病毒Cwhite spot syndrome vir
4、us, WSSV)或称白斑病毒Cwhitespot virus , WSV) ，它是一种双链DNACdsDNA)病毒，能对大多数养殖对虾造成有致命的感染。病毒粒子为长椭圆形，具有囊膜和独特的尾状物，直径120nm150 nm，长270nm290 nm，其基因组大小约300kb 0病毒在细胞核内复制，不形成封闭体Cocclusionbody)。濒死虾在全身外胚层和中胚层起源的组织中呈现出病灶，病毒主要感染的组织包括甲壳下上皮(包括体表和附肢的甲壳下表皮、胃上皮和后肠上皮)、造血组织、跑、结缔组织、触角腺、血细胞和淋巴器官等。感染早期在核内形成的包涵体Cincl usion)呈嗜酸性，随着病毒的快
5、速复制，造成核内染色质边移，细胞核肥大，包涵体的嗜碱性也越来越强。2.2 技术原理苏木精-伊红CH-E)染色在组织学和病理学中是一种常规染色方法。通过染色液苏木精-伊红与组织细胞的不同组分分别相结合，使细胞核、细胞质和细胞内其他结构产生反差明显的蓝紫色和红色，而可清晰地观察到各种不同的组织结构病理变化。3 试剂和材料3. 1 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸悟水或去离子水或相当纯度的水。3.2 石蜡(熔点52oC54 OC):切片级。3.3 二甲苯。3.4 元水乙醇。3.5 95%乙醇。3.6 过滤海水z盐度为2030的海水在室内放置1周后，经滤纸和0.22m滤膜过滤。3.
6、7 戴维森民AFACDavidsonsAFA)固定液z见附录A的规定。1 GB/T 28630.4-2012 3, 8 迈东班尼特苏木精(M吕yer-Rcr;n巳ttH，matoxyli川染色液7见阳录A的规定。3.9 伊红-焰红染色液z见附录A的规定。3, 10 粘片剂:见附录A的规定。3. 11 85 %乙薛z见附录A的规定。3. 12 80%乙醇z见附录A的规定。3.13 75%乙醇z见附录A的规定。3.14 50%乙醇z见附录A的规定。3.15 阳性对照为受wssv感染且显示明显病理变化的对虾组织切片(苏木精-伊红染色)。3.16 阴性对照为未受wssv感染的正常的对虾组织切片(苏木精
7、-伊红染色。4 仪器设备4. 1 石蜡切片机z满足4m7m厚度的石蜡连续切片要求。4.2 程控组织脱水机或使用于工脱水步骤。4.3 石蜡包埋机或使用于工包埋步骤z满足石蜡切片机对石蜡块规格的要求。4.4 程控切片染色机或使用于工染色步骤。4.5 展片水浴锅z敞口，无盖水浴锅或使用自制保温盒加一定温度的水代替。4.6 平板烘片机z室温至1000C或使用恒温箱代替。4. 7 显微镜z带高倍镜(40X)和油镜(100X)。4.8 毛笔。4.9 小慑子。4. 10 载玻片。4. 11 盖玻片。4.12 玻片架。5 操作步骤5. 1 样品准备5. 1. 1 样品采集的要求和固定方法见附录B的规定。5.
8、1. 2 在制作切片前，按照附录B的方法进行取材修整，应保证标本的胃和鲤能被有效地切片。5.2 脱水75%乙醇(105min)85%乙醇(105min)85%乙醇(105min)95%乙醇(45min)95%乙薛(45 min)元水乙醇(45min)无水乙醇(45min)。5.3 透明无水乙醇-二甲苯(1: 1,25 min)二甲苯(20min)二甲苯(20min)。5.4 浸蜡纯石蜡(80min)纯石蜡(80min)。5.5 包埋用石蜡包埋机进行包埋。2 GB/T 28630.4-2012 5.6 切片用石蜡切片机切片，厚度5f1-ill。对每个石蜡包埋块至少切电两块不连续的切片。5. 7
9、展片展片水浴锅(40.C)中展片，用涂有一层粘片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机上于45.C烘片2h。5.8 染色二甲苯(5min)二甲苯(5min)元水乙醇(2min)无水乙醇(2min)95%乙醇(2min) 95%乙醇(2min)80%乙晖(2min)80%乙醇(2min)50%乙醇(2min)蒸锢水(2min)蒸馆水(2min)蒸馆水(2min)迈尔-班尼特苏木精染色液(5min)缓慢流动的自来水(6min)伊红焰红染色液(2min)95%乙醇(80s)95%乙醇(2min)元水乙醇(2min)无水乙醇(2min)二甲苯(150s)二甲苯(150s)二甲苯(150s)。5.9 封片滴加2
10、滴中性树胶封片。5. 10 观察明视野显微镜下观察。6 结果判定6. 1 正常样品的组织切片经H-E染色后，核质反差明显，细胞质染成红色，细胞核染成蓝紫色。6.2 白斑综合征的病灶主要出现在对虾的甲壳下上皮(包括体表和附肢的甲壳下表皮、胃上皮和后肠上皮造血组织.结缔组织、鲍、触角腺、血细胞、淋巴器官等组织中9最方便观察的组织是覆盖有甲壳质的胃上皮。在肝膜腺管上皮、中肠上皮和肌肉细胞中元感染病灶，但在这些组织中的结缔组织和血细胞中可见到病灶。6.3 受感染的细胞，其细胞核的核仁消失，早期感染在核内出现嗜酸性着色(显红色)，晚期感染的细胞核肿大，染色质边移，核内呈不同程度地较均匀的嗜碱性着色(紫色
11、)。核内嗜酸性着色(显红色)，较深且均一。6.4 诊断结果可疑时，补充核酸探针的原位杂交检测或PCR检测进行确诊。3 GB/T 28630.4-2012 A.1 85%Z醇95%乙醇加水定容至混匀，室温贮存。A.2 80%Z醇95%乙醇加水定容至混匀，室温贮存。A.3 75%Z醇95%乙晖加水定容至混匀，室温贮存。A.4 70%Z.醇95%乙醇加水定容至1昆匀，室温贮存。A.5 50%乙醇95%乙薛加水定容至1昆匀，室温贮存。附录A(规范性附录)试剂配方850 mL 950 mL 800 mL 950 mL 750 mL 950 mL 700 mL 950 mL 500 mL 950 mL A
12、.6 戴维森氏AFACDavidsonsAFA)固定渡4 95%乙醇330 mL 甲醒(臼37%)220 mL 冰乙酸115 mL 海水(用于海洋甲壳类)或自来水335 m 混匀，室温密封贮存。A.7 R-F固定fl95%乙醇407 mL 甲醒(37%) 349 mL 海水(用于海洋甲壳类)或自来水222 mL 1昆匀，加入氨水(含28%30%NH3)约22mL.将pH调整到6.07. 00 室温密封贮存。A.8 迈尔班尼特苏木精染色液热水苏木素腆酸铀饵明矶拧攘酸1000 mL 1. 0g 0.2 g 90.0 g 1. 0g 水合三氯乙醒50.0 g 按上述顺序混合，溶解后即可使用，室温贮存
13、。A.9 1%伊红贮存液存贮温室中瓶)色性?棕喇EY后红解伊水溶A.10 1 %焰红贮存遭焰红B(水溶性)水溶解后置于棕色瓶中，室温贮存。A. 11 伊红-焰红染色班1%伊红贮存液1%焰红贮存液95%乙醇冰乙酸泪匀后即可使用，室温贮存。A.12 粘片剂明胶热水5 g 500 mL 1 g 100 mL 100 mL 10 mL 780 mL 4 mL 1 g 100 mL GB/T 28630.4-2012 5 GB/T 28630.4-2012 溶解后，加入z苯酣2 g 甘油15 mL 混匀，在棕色瓶中室温贮存。6 GB/T 28630.4-2012 附录BL规范性附录)甲壳类动物疾病诊断采
14、样原则与方法B. 1 采样目的甲壳类动物的疾病诊断通常出于三个目的之-.a) 疾病流行状况的监测;b) 种苗或场地的健康证书zc) 疾病发生后的诊断。对于不同目的进行分析所需的样品类型和数量极不相同。B. 1. 1 疾病发生后的诊断在临床发病的情况下，应从活的或濒死的甲壳类动物中仔细选择带有特征性病灶的高质量标本，强调标本应具有代表性，并且是濒死的或临床发病的。避免采集死后的标本，采样时要根据诊断方法考虑样品所需的保存条件。要对已发生的疾病进行诊断，建议最少采集100个幼体标本，50个后期幼体(如仔虾、仔蟹)标本、10个稚体(如幼虾、稚蟹)或成体(如成虾、亲蟹等)的标本。如果临床病症明显，可采
15、集更多的数量。不过，上述推荐的最少数量只是一个指导性的参考量，应强调仔细选择标本的质量比随便捡出上百个标本来充数要更有价值得多。B. 1.2 对无症状的甲壳类动物的诊断要监测疾病流行情况、或检测元症状感染的病原、或核准健康证书，所需的采样数量就应该用统计学方法来确定。先假定感染的检出率大于或等于2%、5%、10%、20%等，再对不同大小的群体计算所需的最少样品数量，该数量应能使样品中出现感染标本的概率满足95%的可信限。对不同大小的群体，所需要的采样数量已被计算成预定的表格(参见表B.1)。为了监测疾病流行或核准健康证书，对不同大小的群体进行诊断所需的样品数量应与表B.1相符，并取其最低的假定
16、检出卒，即2%。为了诊断群体中似乎存在的无症状感染，可假定检出率高于5%，从表B.1查出所需的采样数量。表B.1各种大小的群体在推测病原检出率不同时满足95%可信限的采样数量各假定检出率的采样数量群体大小2% 5% 10% 20% 30% 40% 50% 50 50 35 20 10 7 5 2 100 75 45 23 10 9 7 6 250 110 50 25 10 9 8 7 500 130 55 26 10 9 8 7 1 000 140 55 27 10 9 9 8 1 500 140 55 27 10 9 9 8 7 GB/T 28630.4-2012 表B.1 (续)各假定检出
17、率的采样数量群体大小2% 5% 10% 20% 30% 40% 50% 2000 145 60 27 10 9 9 8 4000 145 60 27 10 9 9 8 10 000 145 60 27 10 9 9 8 二注100000 150 60 30 10 9 9 8 注:表格中的采样数量是指实际被有效分析的样品数，如果所采集到的样品不一定每份都能分析到，则应采集更多样品。例z对于100000尾仔虾的群体来说，在60尾样品中查出3尾阳性，则该群体存在5%病原检出率的结果具有95%的可信度。对不同病原的监测，还应注意最适于采样的生活期有差异。例如，要监测对虾杆状病毒病、斑节对虾杆状病毒病或
18、杆状病毒的中肠腺坏死，最佳采样期是幼体和早期仔虾;要监测涛拉病、白斑综合征和黄头病，最佳采样期是幼虾和亚成年虾;要监测整虾瘟，最佳采样期是幼整虾和成年整虾。B. 2 不同诊断方法所需样品的采集要求B. 2.1 直接显微镜检查或组织印片/涂片染色检查的样晶用于直接镜检的样品应在采集后立即处理，起码要求能做到制备好风干的组织印片或涂片。待检样品尽可能使用活标本，如果得不到活标本，至少也应使用冰鲜或用缓冲的10%甲醒(37%)固定的标本。B.2.2 组织学诊断的样晶B. 2. 2.1 采样时样晶要求采样时，应尽量减轻对动物造成的胁迫，固定前需要运输或临时暂养时要保证水中有充足的含氧量。B.2.2.2
19、 固定班要求准备好充足的固定液，一般原则是一体积的组织样品最少应十倍体积的固定液(例如，10g对虾组织应要100mL固定液)。大多数组织学诊断都可使用戴维森氏AFA固定液(见附录A)。该固定液可快速渗透，能有效阻止甲壳类的组织自溶，且其酸性可使甲壳脱锦。如果样品要准备进行免疫组织化学分析或进行RNA病毒的原位杂交诊断，可采用非酸性的R-F固定液(见附录A)。但R-F固定液不应该用于常规组织学样品的固定，因为它对组织的渗透较慢，且不能使甲壳脱钙，用它固定的组织可能会导致切片和染色困难。B.2.2.3 不同样品的固定方法幼体和仔虾z用细筛绢或吸管选取标本。将采集的个体直接浸人10倍体积的固定液中，
20、固定12h 24 h，然后转移到70%乙障中长期保存。大的仔虾和小的幼虾:按上述方法选取并采集标本。用注射针尖或解剖刀尖划破甲壳，将采集的个8 GB/T 28630.4-2012 休直接浸人10倍体积的固定液中，固定12h24 b然后转移到70%乙醇中长黯悍存。大的幼虾以及成虾:用注射器将体重5%10%的固定液注射到活虾体内。先对肝膜腺区域分2处3处进行注射，然后将固定液注射到第1、第3和第6腹节。头胸部.特别是肝膜腺区域应该多注射一些。注射使虾完全死亡，然后立即用解剖刀片划开甲壳，在头胸区的划口沿着头胸甲中线的右侧，在腹节区的划口沿着腹节右侧的中部。再将个体浸入10倍体积的固定液中，固定24
21、h，然后转移到70%乙酶中长期保存。体重大于12g的虾或蟹z按上述方法注射并划破甲壳，然后将虾体在头胸和腹节连接处的后面横切，如果虾体较大，再在腹节中部横切。将各部分浸人10倍体积的固定液中，固定24h，如果个体较大或甲壳较硬，应延长固定时间，直到72h，然后转移到70%乙醇中长期保存。个体很大的虾或蟹:注射固定液后，对个体解剖，取出应进行组织学分析的组织或器官，分别浸人10倍体积的固定液中，固定12h24 h，然后转移到70%乙醇中长期保存。B.2.2.4 样晶编号、登记和标签在采集样品时应对标本进行编号和登记，并根据编号记载标本的全部说明档案，包括标本种名、龄期、重量或大小、来源、个体症状
22、、群体健康状态以及其他相关信息。要使用抗水的纸条或毛面塑料纸做样品标签，并用2B铅笔在标签上注明标本登记编号及其主要说明，将标签直接放人与该标本相同的含固定液包装中，不要用钢笔、圆珠笔或记号笔作标签。B.2.2.5 样晶的包装和运输大体积的固定液或含乙薛榕液不能进行邮寄或运输，样品运输前应进行相应的处理。在运输前12 h，将样品从70%乙醇中转移到50%的乙醇中保存以降低样品中的乙醇含量。包装前将样品从50%乙醇中取出。幼体、仔虾或小的幼虾标本转移到具密封圈的螺口聚丙烯塑料管中，放人标签，再填充少许吸水纸，然后用50%乙醇浸透，盖紧管帽;较大的标本用3层5层白色纸巾完全包裹，将纸巾包裹的标本放
23、入一个厚的聚丙烯塑料袋中，用50%乙薛浸透纸巾，在袋内放入标签，将塑料袋用热塑封口机熔封。将上述塑料管或塑料袋用2层吸水纸包裹，放人一个厚塑料袋中并完全密封。多个小塑料袋再封入一个较大的塑料袋内，最后所有的塑料袋放入一个抗压的运输用包装箱内，填入防压充填物，进行邮寄或运输。B.2.2.6 组织学标本修整的取材从50%或70%的乙醇保存液中取出固定好的标本，置于木头或塑料垫板上，根据标本的大小进行修整，以便确保感兴趣的组织能被有效切片。幼体或仔虾z用擦镜纸将个体包好，放于脱水盒中进行脱水，包埋时去掉擦镜纸，用热锤子调整标本在包埋模具中的位置进行整体包埋。小于3cm的幼虾z用单面刀片或解剖刀沿对虾
24、的中线右侧将标本纵剖两半。如果虾体较长，再从第2腹节处横切两半。取包含中线的左侧进行脱水，包埋时纵切面向下包埋。大于3cm的幼虾或亚成年虾z用单面刀片或解剖刀从对虾的头胸和腹节连接处切断，再将头胸沿中线右侧纵剖两半。取包含中线的左侧，切去步足80%的长度，剔净胃内容物;如果头胸长度大于1cm，tJ取包含胃部和肝膜腺部分的1cm以下的部分才日果厚度大于0.5cm，削去高出0.5cm的部分。再从不含中线的右侧头胸部斜切下鲍区。将切取的含中线左侧头胸部和切下的鲍区放入同一个脱水盒进行脱水，包埋时将含中线左侧头胸部的纵切面向下，鲤区的纵切面向上，前后对错地放入同一个包埋模具中包埋。如果需要对腹节部分进
25、行组织学分析，选取感兴趣的腹节或第l、第3和第6腹节，从第1和第3腹节横切出厚度不超过0.5cm的段，对第6腹节纵切，分别脱水和包埋。9 GB/T 28630.4-2012 大于8cm的虾或蟹:参照上述修整方法，按照长宽不超过1cmXl cm，厚度不超过0.5cm也矗求对感兴趣的组织所在的区域进行修整;对特定的组织或蟹的组织，也可考虑进行横切，甚至独立地解剖出相应的组织器官，按需要分别进行脱水和包埋，胃和肠道中的内容物应剔除干净以免损伤切片刀。B.2.3 分子生物学或免瘟学诊断的样晶B. 2. 3.1 样晶采集和保存要点用于PCR、RT-PCR或核酸探针斑点杂交检测的样品应注重保护病原的核酸。
26、用于抗体的免疫分析检测的样品应注重保护病原的抗原活性。用于核酸检测或抗体检测的样品应十分小心地防止各样品间的交叉污染，每个样品应使用新的一次性塑料袋或塑料管和内置标签。不同的样品采集和保存方法对不同的检测方法的适用性有差异，并且可能应增加一些辅助的样品处理手段，因此在样品采集和运输时要注明曾使用过的保存条件，使实验室能根据其保存条件进行相应处理。B. 2. 3.2 不同类型样晶的采集和运输B. 2. 3. 2. 1 活标本:活标本可在现场处理或以活体形式运输到诊断实验室。B.2.3.2.2 血淋巴:许多分子生物学或免疫学检测的首选样品是血淋巴，样品可用注射器从心脏、腹部血窦采集，或切断附肢采集
27、。B.2.3.2.3 冷藏标本z应经24h以内运输到实验室进行分子生物学或免疫学检测的样品可采用这种方法保藏。运输前，应将各样品独立装袋，用足量的冰将样品塑料袋埋人泡沫塑料箱中，进行合适的包装后运输到实验室。B.2.3.2.4 深冻标本z采集活标本，用干冰或用低于一20.C的冰柜速冻，将标签放入独立的样品包装袋，用足量的干冰将样品包装袋埋人泡沫塑料箱中，进行合适的包装后可满足较苛刻的运输要求。B. 2.3.2.5 乙醇保存的样品z对于难以用冷藏或冷冻方法存放和运输样品的情况，可用90%95%的乙醇来保存和运送某些类型的样品。小于2g3g的个体、解剖出的组织或抽取的血淋巴可保存于90%95%的乙
28、醇中，做好相应标签，运输前1h，将保存的标本转移到50%的乙醇中，然后按B.2. 2. 5 的方法进行包装和运输。B.2.3.2.6 特殊采样液保存的样品:一些特定的分子生物学或免疫学检测方法或试剂盒提供了样品的采集、保存和运输用试剂，可为样品的保存、运输和后续的检测操作提供便利。如SEMP-SSC采样液可用于斑点杂交检测的核酸样品的保存和运输、SEMP-Tris采样液可用于PCR和核酸探针检测的核酸样品保存和运输，TrizoF川可用于RT-PCR样品的保存和运输等。但要注意，不同的采样液保存的样品通常只适用于该试剂指定的检测方法，而并不一定适于进行其他的诊断。1) 这是适合的市售产品的实例。
29、给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。10 中华人民共和国国家标准自斑综合征(WSD)诊断规程第4部分z组织病理学诊断法GB/T 28630.4-2012 * 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1字数21千字2012年11月第一版2012年11月第一次印刷* 书号:155066. 1-45623定价18.00元GB/T 28630.4-2012 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有僵权必究举报电话:(010)68510107打印日期:2012年12月11日F008AOONFON-23NH阁。
