1、ICS 67040X 00中华人民共和国国家标准农业部1025号公告一12008牛奶中氨基苷类多残留检测柱后衍生高效液相色谱法砸曲Performance Liquid Chromatographic Method by postcolumn derivised for Determination of aminoglycosidesresidues in milk20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布刖 置农业部1025号公告一12008本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：华中农业大学。本标准主要起草人：袁宗辉、肖爱国
2、、陶燕飞、王玉莲、陈冬梅、黄玲利、彭大鹏、戴梦红、刘振利。本标准系国内首次发布的农业标准。1范围农业部1025号公告一12008牛奶中氨基苷类多残留检测柱后衍生高效液相色谱法本标准规定了牛奶中氨基苷类抗生素残留检测的制样和柱后衍生高效液相色谱测定方法。本标准适用于牛奶中卡那霉素、安普霉素、新霉素、庆大霉素单个或多个残留量检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注Ft期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修定版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
3、GBT 6682分析实验室用水规则和试验方法。3制样3 1样品的制备取适量新鲜或冷藏的空白或供试牛奶，使混合均匀。32样品的保存冷藏贮存备用，有效期1个月。4测定方法4 1方法提要或原理试料用磷酸缓冲液和10三氯乙酸溶液提取，C。sSPE柱净化，甲醇洗脱，氮气吹干，用水定容。高效液相色谱柱后衍生，荧光检测，外标法定量。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合GBT 6682规定的一级水。4 2 1 庆大霉素硫酸盐标准品(C19H39N507H2S04)，含量不得少于99O。422安普霉素硫酸盐标准品(C2。H41N5011H2S04)，含量不得少于98O。423卡那
4、霉素硫酸盐标准品(C19H36N4011H2S04)，含量不得少于980。4 2 4新霉素硫酸盐标准品(C2，H46 N6013H2S04)，含量不得少于99O。425甲醇色谱纯。4 2 6正己烷427磷酸二氢钾优级纯。428硼酸优级纯。429硼酸钠优级纯。1农业部1025号公告一120084 2 10氢氧化钠优级纯。4 2”氢氧化钾优级纯。4212氯化钾优级纯。4 213氯化钠优级纯。4 2 14三氯乙酸优级纯。4 2 15邻苯二甲醛色谱纯。4216磷酸氢二钠优级纯。4 2 17正己烷磺酸钠色谱纯。4 2 18 2一巯基乙醇优级纯。4 219磷酸二氢钠优级纯。4 2 20乙酸优级纯。4 2
5、21流动相A称取无水磷酸二氢钾1300 g，硼酸600 g，加水溶解并稀释至1 000 mL。流动相B称取氢氧化钾560 g，加水溶解并稀释至1 000 mL。流动相c称取氯化钾7500 g，加水溶解并稀释至1 000 mL。4 2 22磷酸缓冲液称取氯化钠850 g，磷酸氢二钠358 g，磷酸二氢钠312 g，加水溶解并稀释至1 000 mL。4223 100三氯乙酸溶液(wv)称取三氯乙酸100 g，加水溶解并稀释至100 mL。42 24 10三氯乙酸溶液(wV)称取三氯乙酸1000 g，加水溶解并稀释至100 mL。4 2 25正己烷磺酸钠溶液称取正己烷磺酸钠094 g，加水溶解并稀释
6、至250 mL。42 26正己烷磺酸钠缓冲液称取正己烷磺酸钠094 g，加水溶解，加乙酸05 mL，用水稀释至250 mL。4 227衍生化试剂称取硼酸钠400 g，氢氧化钠100 g，加水800 mL溶解；称取邻苯二甲醛i00 mg，用甲醇10 mL溶解，将邻苯二甲醛甲醇溶液加入硼酸钠缓冲溶液中，用水稀释至1 000 mL，加2巯基乙醇2 mL，混匀，现配现用。4 2 28标准贮备液分别准确称取安普霉素、新霉素、卡那霉素和庆大霉素标准品适量，用水分别溶解并稀释制得含安普霉素、新霉素、卡那霉素和庆大霉素分别为1 mgmL的标准贮备液，4避光保存，有效期六个月。4 2 29标准工作液准确量取安普
7、霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素标准贮备液适量，用磷酸缓冲液溶解并定容，制得卡那霉素、庆大霉素、新霉素和安普霉素浓度为100pgL、200pgL、500pgL、1 000zgL、2 000zgL、5 000”gL、10 000 pgL的混合标准工作液，4避光保存，有效期一周。4 3仪器和设备4 3 1高效液相色谱仪：配荧光检测器和柱后衍生系统。4 3 2分析天平感量0000 Ol g，感量00001 g，感量0001 g。2农业部1025号公告一120084 33离心机(5 000 rrain)4 3 4冷冻高速离心机(10 000 rrain)4 3 5电热恒温水浴锅4 3 6旋涡混合器4
8、3 7组织匀浆机43 8 CSPE柱(100 me3mL】44测定步骤441试料的制备试料的制备包括：取混合均匀后的供试样品，作为供试试料。取混合均匀后的空白样品，作为空白试料。取混合均匀后样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 4 2提取量取牛奶试料(5o05)mL置聚丙烯离心管中，加磷酸缓冲液5 mL，混匀，静置30 min，加10三氯乙酸溶液5mL，混匀，静置10min，4 200 rmin离心10min，取上清液至聚丙烯离心管中，加正己烷5 mL，混匀，静置10 min，弃正己烷层，加正己烷磺酸钠溶液2 mL，混匀，备用。4 43净化固相萃取柱依次用甲醇、水、正已烷磺酸钠缓冲
9、液各3 mL预洗，取备用液过柱，依次用水、正己烷磺酸钠缓冲液各1mL淋洗，甲醇2mL洗脱，收集洗脱液，40水浴氮气吹干，用水10mL溶解，并转入15 mL聚丙烯离心管，10 000 rmin离心10 min，取上清液供高效液相色谱分析。4 44标准曲线的备制取标准工作液，高效液相色谱检测，将测得的峰面积与相对应浓度绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。4 45测定445 1液相色谱条件a)色谱柱：阳离子交换柱(Cationexchange)4mmXl50mm离子交换柱。b)梯度洗脱程序：Time(min) A() B() C()O 65 35 015 65 35 O151 48 48 420 4
10、8 48 4c)流速：1 mLmind)检测波长：EX：235 nm，Em：465 nme)进样量：50“Lf)柱温：30g)反应器温度：45h)衍生液流速：03 mEmin4 45 2液相色谱测定取适量试样溶液和相应的标准溶液，做单点或多点校准，按外标法，以峰面积积分值定量，标准工作液及试样液中氨基苷类的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，在上述色谱条件下，标准溶液和试样3农业部1025号公告一12008的液相色谱图见附录A。446空白实验除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。45结果计算与表述试料中氨基苷类的残留量(pgL)：按式(1)计算 X一糌式中：x试料中氨基苷类残留量g
11、L)；A试样溶液中氨基苷类的峰面积；A；标准工作液中氨基苷类的峰面积；C5标准工作液中氨基苷类的浓度(“gL)；V溶解残余物所得试样溶液体积(mL)；M样品体积(mL)。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留至小数点后两位。5检测方法灵敏度、准确度、精密度5 1灵敏度本方法在牛奶中卡那霉素、安普霉素和庆大霉素检测限为10”gL，定量限为20#gL，新霉素的检测限为25 pgL，定量限为100 pgL。5 2准确度本方法在牛奶中卡那霉素、庆大霉素和安普霉素添加浓度为20 pgL-100 pgL的回收率为700H110o；新霉素添加浓度为100“gL1 000 ug
12、L的回收率为80o-1100H。5 3精密度本方法的批内变异系数CV,15，批间变异系数CV26。农业部1025号公告一12008附录A(资料性附录)氨基苷类药物的高效液相色谱圈(A：kanamycin；B：apramycin；C：neomycin；D：gentamycin)mAU1210 80 6o 40 200 2氨基苷类药物(卡那霉素、安普霉素、庆大霉素浓度为100|lgL新霉素浓度为500斗gL)的标准溶液衍生物色谱图牛奶样品空白色谱图农业部j 025号公告一12008O牛奶添加氨基苷类药物(卡那霉素、安普霉素、庆大霉素浓度为20 l喀L新霉素浓度为100斗gL)衍生物色谱图州。嘶吣|耋。幡扔唧
