1、ICS 67120B 45中华人民 共禾口，、-1 国国家标准农业部1025号公告一11-2008猪尿中13一受体激动剂多残留检测液相色谱一串联质谱法Determination of5-agonists residues in pig urineby liquid chromatography-tandem mass spectrometry20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布目 次前言“1范围，2规范性引用文件3制样31样品的制备32样品的保存4测定方法41方法提要或原理42试剂和材料43仪器和设备44测定步骤45结果计算和表述5检测方法灵敏度、准确度和精密度。
2、51灵敏度-52准确度。53精密度附录A(资料性附录)0受体激动剂特征离子质量色谱图农业部1025号公告一112008I1l11111122444445农业部1025号公告一112008前 言本标准附录A是资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：王树槐、孙雷、刘琪、汪霞。本标准系首次发布的国家标准。农业部1025号公告一112008猪尿中B一受体激动剂多残留检测液相色谱一串联质谱法1范围本标准规定了猪尿中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗残留检测的制样和高效液相色谱串联质谱的测定方法。本标准适用于猪尿中克仑特罗、莱克多巴胺
3、、沙丁胺醇和西马特罗单个或混合物残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和试验方法农业部农牧发20031号兽药残留试验技术规范(试行)3制样3 1样品的制备取适量新鲜或冷冻的空白或供试样品，解冻摇匀备用。3 2样品的保存-20以下贮存备用。4测定方法4 1方法提要或原理试样中的8一受体激动剂残留物经酶解，离心后将上清液调
4、pH，用异丙醇一乙酸乙酯提取，再用MCX柱子净化，吹干浓缩后用高效液相色谱一串联质谱法测定，同位素内标法定量。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GBT 6682规定的一级水。4 2 1盐酸克仑特罗、盐酸莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗对照品：纯度大于98oH。4 22盐酸克仑特罗一D9、盐酸莱克多巴胺一D5、沙丁胺醇D3、西马特罗一D，对照品：纯度大于98oH。423乙酸铵缓冲液(2toolL)：称取154 g乙酸铵，溶解于100mL水中，用适量乙酸调pH至52。4 2 4氢氧化钠溶液：5 molL。425异丙醇一乙酸乙酯：(6+4，VV)。4 2 6甲醇：色
5、谱纯。427甲酸水溶液：2。42 8氨水甲醇溶液：5。4 2 9甲醇一O1甲酸水：(5+95，yV)。4 2 10 0一盐酸葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶(口Glucuronidasearyl sulfatase)。1农业部1 025号公告一1120084 2 11标准储备液(100“gmL)：准确称取适量的盐酸克仑特罗、盐酸莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗对照品，按克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗计，用甲醇分别配制成100 pgmL的标准储备液，-20冰箱中保存，有效期为3个月。4212混合标准储备液(1“gmL)：分别准确量取10mL的克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗标准储备液至1
6、00mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，一20冰箱中保存，有效期为3个月。4 2 13同位素内标储备液(100gmL)：准确称取适量的盐酸克仑特罗一D9、盐酸莱克多巴胺Ds、沙丁胺醇D3和西马特罗一D7对照品，按克仑特罗D9、莱克多巴胺一D5、沙丁胺醇一D3和西马特罗一B计，用甲醇配制成100“gmL的标准储备液，20冰箱中保存，有效期为3个月。4 2 14同位素内标丁作液(100 ngmI)：分别准确量取适量的同位素内标储备液至同一容量瓶中，用甲醇稀释定容成浓度为100 ngmL的同位素内标工作液，一20下冰箱中保存，有效期为3个月。4 3仪器和设备4 31 高效液相色谱串联质谱仪(配电喷雾离子
7、源)。432漩涡振荡器。4 33电热恒温振荡水槽。4 3 4 pH计。43 5旋转蒸发仪。4 36固相萃取装置。4 3 7 Oasis MCX固相萃取柱(60 mg3 mL)或相当者。43 8氮吹仪。439微孔滤头：045m。4 4测定步骤4 4 1试样的制备试样的制备包括：取摇匀的供试样品，作为供试试样；取摇匀的空白样品，作为空白试样；取摇匀的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。4 4 2酶解准确量取5 mL尿样于50 mL离心管内，加入05 mL 2 molL的乙酸铵缓冲液(pH一52)，再加入40“L的口盐酸葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶，涡旋混匀，于37。C下避光水浴振荡1
8、6 h。4 4 3提取酶解后，添加100“L100 ngmL内标物于待测样品中，涡旋混匀，10 000 rrain高速离心10rain，转移上清液于另一50mL离一tl,管内，用5toolL的NaOH溶液调pH至98=t-02，加入10mL异丙醇一乙酸乙酯(6+4)，再加入15 g2 g的固体氯化钠饱和水相，涡旋后振摇10min，5 000 rmin离一E,10min，取上清液于50 mL鸡心瓶内，再用10 mL异丙醇一乙酸乙酯(6+4)重复提取一次，合并上清液，50。C下旋转蒸干，用5 mI。2 molL的乙酸铵溶液(pH-52)溶解，备用。4 44净化MCX柱子依次用3mL甲醇，3mL水活
9、化，取备用液全部过柱，再依次用3mL水、3mL 2的甲酸水溶液、3 mL甲醇淋洗，减压抽干，用5 mL 5的氨水甲醇溶液洗脱；洗脱液在50。C下用氮气吹干。残余物用05mL的甲醇一01甲酸水(5+95)溶解，过滤膜后供高效液相色谱一串联质谱法测定。4 4 5标准曲线的制备2农业部1025号公告一一2008精密量取适量的克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗混合标准工作液，制得1 ngmL、2 ngmL、4 ngmL、10 ngmL、20 ngmL、50 ngmL各系列对照溶液(内标均为10 ngmL)供高效液相色谱一串联质谱法测定。446测定4 4 6 1液相色谱条件色谱柱：XBridge
10、C18柱(150 mmX 21 Film，粒径5m)或相当者；流动相：A相：01甲酸甲醇溶液；B相：01甲酸水溶液；梯度洗脱：0min5min，5A线性变化至60A；5min 12rain，60A线性变化至90A；12 min14 min，保持90A；14 min25 min，90A线性变化至5A；流速：02 mLmin；柱温：30；进样量：50“L。4 4 6 2质谱条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电离电压：35 kV；萃取电压：20V；预六极杆电压：05 V；源温：110；雾化温度：350；锥孔气流速：50 Lh；雾化气流速：450 Lh；光电倍增器：
11、650 V；氩气：370e 3。定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量见表1。表1 四种B一受体激动剂和内标的定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量药物 定性离子对，mz 定量离子对，mz 锥孔电压，V 碰撞能量，eV276，9：203 0 15克仑特罗 2769D2030 222769259 1 1130231072 30莱克多巴胺 302321641 2230231641 1524021482 18沙丁胺醇240 21482 2424022222 1022032022 10西马特罗 220 3二2022 1622031602 16克仑特罗B 28612041 2861=2041 22 15莱克
12、多巴胺B 30731672 30731670 22 15沙丁胺醇B 24321512 24321SL 2 24 18西马特罗岛 2273D1611 22731611 16 16农业部1 025号公告-1 12008446 3测定法取试样溶液和相应的对照溶液，作单点或多点校准，按内标法以峰面积比计算，即得。对照溶液及试样溶液中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗及内标克仑特罗一D9、莱克多巴胺Ds、沙丁胺醇一B、西马特罗一岛的峰面积之比均应在仪器检测的线性范围之内。对照溶液和试样溶液中各特征离子质量色谱图分别见附录A中图A1、图A2。4 47空白试验除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平
13、行操作。45结果计算和表述单点校准：或标准曲线校准：由求得a和b，则r一叁笪!g!“A。A：C 7。今一。导+6n o”Ci-鱼(会一6)a A u按下式计算试样中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗残留量：x一譬(4)式中：G试样溶液中相应口一受体激动剂的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；C。试样溶液中相应B受体激动剂内标的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；C；对照溶液中相应口一受体激动剂的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；C7r对照溶液中相应8受体激动剂内标的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A试样溶液中相应口受体激动剂的峰面积；A。试样溶液中相应口一受体激动剂内标的峰面积；A
14、，对照溶液中相应8一受体激动剂的峰面积；A7r对照溶液中相应8一受体激动剂内标的峰面积；x试样中相应D一受体激动剂的残留量，单位为纳克每毫升(ngmL)；矿溶解残余物所得试样溶液体积，单位为毫升(mL)；V试样的体积，单位为毫升(mL)。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。5检测方法灵敏度、准确度和精密度5 1灵敏度克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和西马特罗在猪尿中的检测限为03 rigmL，定量限为05 rigmL。5 2准确度本方法在05 ngmL2 ngmL添加浓度的回收率为60120。6。5 3精密度本方法的批内相对标准偏差20，批间相对标准偏
15、差20。附录A(资料性附录)p一受体激动剂特征离子质量色谱图农业部1 025号公告一112008001 lOngmL sta 10023。， 。：。，。27。-。S。e。p，-。2。0。0+7j 286i204inj，、，d!j；，r，T，1，r，T，1，285e4200 400 600 8 00 1000 12 00 1400 16 00071000927。07 128 4：”8M扪曲a2n7n6e19sE20S+3* 4 962“一01r叶rr丌rT竹T甲11甲丌卜r“TT11r下1r一2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00 14 00 1600o嚣y 9i9 3：
16、舳h妣ann捌els。E，S：+女j q， 169e4j 。一0。PTrT11r”T竹1nP+十_1”r”1”r丌T”1”rlOngmL 8td200 400 6 00 8 00 10 00 12 00 1400 16 oo200 400 600 800 1000 1200 14 00 16 002 00 4 00 600 8 00 10 00 1200 14 00 160007092707 7 19 I：MRM of 3 Channels ES+100一 227 3161 l。； l 176“一ol，。，。，j；，。，。，一 2(30 4 00 600 8 00 1000 12 00 14
17、00 16001西马特罗特征离子质量色谱图(220 3202 2)1西马特罗一功特征离子质量色谱图(227 3161 1)；2沙丁胺醇特征离子质量色谱图(240 21482)；2+沙丁胺醇一璐特征离子质量色谱图(24321512)；3莱克多巴胺特征离子质量色谱图(30231641)；3莱克多巴胺一D5特征离子质量色谱图(307 31672)；4 克仑特罗特征离子质量色谱图(2769203 o)；4+克仑特罗一n特征离子质量色谱图(28612041)。图A 1 10 ngmL标液中四种B一受体激动剂及内标特征离子质量色谱图5嚅；加0农业部1025号公告-1 1200860710m92、7_05
18、10254：MRMd3Cba2r7r6e19sE2SO+31” 0， 。107”e；岩1 J一。土一，r。，-0上tr。r-一黑：。05 965 3：肌删hanndsES+00 lOz：1j 0】， 3l 99“美 f一ol，。，。wr一-一一Lkr一-r一-一一一-tr一-rrrr一07092、7_05 9_653：MRM of 4c蚴hnes164ES+100I j眦jlb珥摹I 1 5 34e4一。L。，。，、，。，Ll，+，。，。，一，。200 400 6 00 8。0 j000 i2 1400 16001西马特罗特征离子质量色谱图(2203202 2)lL一西马特罗一n特征离子质量色谱图(227 31611)；2沙丁胺醇特征离子质量色谱图(240 21482)；2抄丁胺醇n特征离子质量色谱图(243，21512)；3莱克多巴胺特征离子质量色谱图(3023164 1)；3菜克多巴胺一D5特征离子质量色谱图(307 31672)；4 克仑特罗特征离子质量色谱图(2769：203o)4+克仑特罗一n特征离子质量色谱图(286 12041)。图A 2 1 ngmL空白猪尿添加试液中四种B一受体激动剂及内标特征离子质量色谱图器M_量引L-善拼一揲莹n一M叮搬8一量m8。加”从。8懈8一一翟曩
